加减清营汤对H2O2损伤的血管内皮细胞保护作用研究
【摘要】 目的：观察加减清营汤对H2O2损伤的血管内皮细胞的保护作用。方法：体外培养内皮细胞ECV304，用380 μmol/L H2O2损伤细胞，大鼠随机分成正常组、模型组、加减清营汤组和阳性药物对照组，用血清药方法给药，检测各项指标。结果：与模型组比较，加减清营汤含药血清组的NOS活性、T?AOC显著提高，MDA含量、LDH活力显著降低(P<0. 05)。结论：加减清营汤可降低H2O2对ECV304的损伤程度，具有明显的保护作用，其机理可能与维持细胞膜结构的完整性、提高抗氧化能力以及提高NOS活性等途径有关。
【关键词】 加减清营汤 血栓闭塞性脉管炎 H2O2 血管内皮细胞 大鼠
加减清营汤是在清代温病学家吴鞠通的清营汤的基础上结合王灿晖教授脉管炎的经验组合成方，全方由丹参、赤芍、生地黄、牡丹皮、金银花、连翘、毛冬青等8味药组成,具有清营泄热解毒、活血祛瘀通脉、养阴益血敛疮等功效。血栓闭塞性脉管炎(TAO)属中医学“脱疽”范畴，是一种常见的周围血管疾病，其发病率居周围血管病的第二位，多见于青壮年男性。临床以加减清营汤治疗TAO的疗效已得到证实。为探讨该方治疗TAO的机制，本实验采用体外细胞培养方法，用H2O2诱导血管内皮细胞损伤模型，研究加减清营汤对内皮细胞的保护作用。现将结果报道如下。
1 实验材料
1. 1 细胞、药物及试剂 细胞：人脐静脉血管内皮细胞株(ECV304)：购自院上海生物化学研究所。药物：加减清营汤：全方由丹参、赤芍、生地黄、金银花、连翘、毛冬青等组成,药材由南京中医药大学国医堂门诊部药房提供，符合2005版药典要求。加8倍和6倍水煎煮2次，合并、浓缩，制成100%煎剂(即1 mL/1 g生药)。试剂：RPMI?1640培养粉：GIBCO，USA，批号：2535081。小牛血清：杭州四季青生物工程材料研究所，批号:040603。胰蛋白酶：Typrin，1:250，Amerso，USA，批号：0428S05。T?AOC试剂盒、MDA试剂盒、NO试剂盒、LDH试剂盒、NOS试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供，批号均为070901。
1. 2 动物 SD雄性大鼠8只，体重(280±20) g，由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供，合格证号：SCXK(沪)2003?0003。
1. 3 仪器 5%CO2培养箱(NAPCO，USA)；倒置相差显微镜(Olympus,Japan)；紫外?可见分光光度计(UV?1100 SPECTYOPHOTO上海美谱达仪器有限公司生产)，水浴恒温箱(江苏国胜实验仪器厂生产);移液器等。
2 实验方法
2. 1 药物血清的制备 加减清营汤水煎剂以临床等效剂量的2. 5倍给大鼠连续灌胃3 d，2次/d，另设正常血清对照组：大鼠给予等量生理盐水灌胃。灌胃前禁食不禁水12 h。于末次灌后1 h，颈动脉取血，以1000 r/min离心10 min，分离血清，然后56℃ 30 min灭活以除去补体，再用0. 22 μm的微孔滤膜过滤除菌，密封后置于-20℃冰箱保存备用。分别制得含药血清和正常对照血清。
2. 2 细胞培养 人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)用含10%小牛血清的培养液,置37℃、5%CO2培养箱内作常规细胞培养，取对数生长期细胞用于实验。
2. 3 细胞分组 正常组：用10%正常对照血清培养，不做任何处理；模型组：用10%正常对照血清培养，加终浓度为380 μmol/L H2O2；加减清营汤含药血清组：加终浓度为380μmol/L H2O2、含10%加减清营汤药物血清的培养液。阳性药物对照组：用10%正常对照血清培养，加终浓度为380 μmol/L的H2O2和终浓度为0. 5 g/L的丹参注射液。
2. 4 LDH、NO、NOS、MDA、T?AOC含量测定 取各组细胞上清液,按试剂盒方法进行操作。
2. 5 统计学处理 应用SPSS 11. 5统计软件进行进行统计分析，先进行方差齐性检验，方差齐用单因素方差分析(One?Way ANOVA);不齐则用SPSS 11. 5在Equal Variance Not Assumed选项中提供的Dunnett’s C(基于标准化全距的两两比较方法)进行分析。所得数据均用(±s)表示。
3 结果
见表1～表4。
表1 加减清营汤对H2O2损伤的ECV304分泌LDH的影响（略）
注：与正常组比较#P＜0. 05，与模型组比较△P＜0. 05
结果发现：模型组LDH值最高，与正常组和加减清营汤组的差别具有统计学意义(P<0. 05)。
表2 加减清营汤对H2O2损伤的ECV304分秘NOS的影响（略）
注：与正常组比较#P＜0. 05，与模型组比较△P＜0. 05
结果发现：模型组NOS值最低，与正常组和加减清营汤的差别具有统计学意义(P<0. 05)。
表3 加减清营汤对H2O2损伤的ECV304分泌MDA的影响（略）
注：与正常组比较#P＜0. 05，与模型组比较△P＜0. 05
结果发现：模型组MDA含量最高，与正常组和加减清营汤组的差别具有统计学意义(P<0. 05)。
表4 加减清营汤对H2O2损伤的ECV304分泌T?AOC的影响（略）
注：与正常组比较#P＜0. 05，与模型组比较△P＜0. 05
结果发现：模型组T?AOC含量最低，与其他各组的差别具有统计学意义(P<0. 05)。
4 讨论
TAO病位在血脉,营热、血瘀、阴伤是其重要的病理因素，营热炽盛、燔灼血脉，瘀血留滞、阴液损伤均可导致脉络失养受损。医学认为：血管壁损伤是血栓形成的基本条件，而从血栓形成角度看，血管壁损伤主要指内皮细胞受损或功能异常［１］，即内皮细胞损伤是管腔内血栓形成的关键环节［2］。
LDH是活细胞胞浆内酶,正常情况下不能透过细胞膜。当靶细胞受损时，细胞膜通透性增高，LDH释放入介质，测定细胞外液的LDH浓度可以定量反映细胞损伤程度［3?4］。本实验显示,H2O2可使细胞外LDH活性显著增加，表明细胞膜受损严重；而加减清营汤组显著降低，表明加减清营汤能维持细胞膜结构的完整性，降低细胞损伤程度。
T?AOC(总抗氧化能力)反映的是机体内抗氧化物质的程度，其测定原理是机体有许多抗氧化物质，能使Fe3+还原成Fe2+，后者可与菲啉类物质形成稳固的络合物，通过比色可测出其抗氧化能力的高低。本实验反映了H2O2使细胞总抗氧化能力显著降低，而加减清营汤则明显增强细胞的总抗氧化能力。细胞膜被自由基攻击，招致膜脂质过氧化， 其主要产物之一MDA可破坏细胞膜，使细胞通透性改变，释放凋亡因子，引起细胞凋亡［6］。模型组MDA显著增加，而加减清营汤组MDA则明显下降，揭示本方TAO机理与抗氧化作用密切相关。
TAO最基本的病理改变就是中小动、静脉内有血栓形成，NO则有极强的舒张血管作用，对血小板聚集和血栓形成有强烈的抑制作用。而NO的生成取决于NOS。实验结果显示,加减清营汤能明显改善H2O2损伤后的血管内皮细胞NOS的活性,从而对恢复NO的供应产生显著的影响。
综上所述，加减清营汤含药血清能够从多方面拮抗H2O2对ECV304的损伤，它通过维持细胞膜结构的完整性、抗氧化、提高NOS活性等途径来保护血管内皮细胞，改善血管内皮功能，实现其治疗TAO的作用。
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