二氮嗪对移植鼠心不同时期心肌组织ATP酶活性的作用
作者：胡志斌 严志?潘晓华 贾静年 周永列
【摘要】 目的 探讨二氮嗪对移植鼠心在术后不同时期心肌细胞膜Na+-K+-ATPase和肌浆网Ca2+-ATPase活性的变化及其对心肌缺血再灌注损伤的作用。方法 采用改良Heron法大鼠颈部异位心脏移植模型。SD雄性大鼠随机分为实验组、对照组和拮抗组，并在术后不同时间（5min、1周、3个月）留取标本，检测心肌细胞膜Na+-K+-ATPase和肌浆网Ca2+-ATPase活性，及观察心肌超微结构。 结果 （1）实验Ⅰ、Ⅱ组心肌细胞膜Na+-K+-ATPase和肌浆网Ca2+-ATPase活性均显著高于相应对照Ⅰ、Ⅱ组（P<0.05）；实验组中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组心肌细胞膜Na+-K+-ATPase活性增高呈递减性显著性减弱（P<0.05），实验Ⅰ组肌浆网Ca2+-ATPase活性显著高于实验Ⅱ、Ⅲ组；余差异无显著性。（2）拮抗组取消实验组DE的这一增高作用。（3）中长期各组均有良好的心肌超微结构保护，肌节清，线粒体肿胀不明显，嵴结构尚清楚，排列整齐；仅Ⅲ组偶有空泡变性。结论 二氮嗪对移植鼠心长期冷缺血保存后，有更好的保存和提高细胞膜Na+-K+-ATPase和肌浆网Ca2+-ATPase的活性，减轻心肌缺血再灌注损伤，维持心肌能量代谢有效地进行来发挥心肌保护作用。
【关键词】 二氮嗪 Na+-K+-ATPase Ca2+-ATPase Celsior
【Abstract】 Objective To evaluate influences of diazoxide on sarcolemmal Na+-K+-ATPase and sarcoplasmic reticulum（SR）Ca2+-ATPase activity in different time following heart transplantation of rats and its effects in ischemic reperfusion injury. Methods One hundred and twelve rats were randomly divided into control group, experiment group and resistant group. The modified Heron’s technique for heterotopic cervical cardiotransplantation in rats by cuff vessel anastomosis was used. The donor’s rat hearts were stored in 4°C Celsior cardioplegia solution or Celsior solution containing diazoxide (30mol/L) with or without blocker 5-hydroxydecanoate (5-HD, 100 mol/L) for 5 hours. And the myocardia which samplinged in 5min, 1 week, 3month time after heart transplantation were used to measure the activities of sarcolemmal Na+-K+-ATPase and SRCa2+-ATPase. The myocardial ultrastructure was also determined. Results ⑴Diazoxide improved the activities of sarcolemmal Na+-K+-ATPase and SRCa2+-ATPase in the experiment group Ⅰand Ⅱthan the control group Ⅰand Ⅱ. In the experiment group, the sarcolemmal Na+-K+-ATPase were significantly degressively ordinal reduced within groupⅠ、Ⅱand Ⅲ. The SRCa2+-ATPase in the group Ⅰwere significantly excelled to group Ⅱand Ⅲ; and other were not. ⑵The cardiac effects of diazoxide were attenuated by 5-HD. ⑶Myocardial ultrastructure injury was alleviated. Conclusions The results suggest that diazoxide could improve the activities of sarcolemmal Na+-K+-ATPase and SRCa2+-ATPase in the cardioplegia and reperfusion period, and decrease the myocardiac damages of ischemia-reperfusion, that enhance myocardial protection.
【Key words】 Diazoxide Na+-K+-ATPase Ca2+-ATPase Celsior
二氮嗪是一种苯丙噻二嗪类衍生物，亦作为一种特异性增强线粒体敏感性钾通道通透性的化合物，在多种心肌缺血再灌注模型中研究应用。多数研究均肯定其特有的心肌保护作用，但其涉及在心脏移植后不同时期对心肌组织ATP酶活性的影响，以及是否通过对心肌细胞膜Na+-K+-ATPase和肌浆网Ca2+-ATPase的作用而起到保护心肌各种代谢的作用，研究甚少。作者就此研究报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
显微外科手术器械产于上海手术器械厂；戊巴比妥钠购自上海化学试剂厂；Celsior液购自法国IMTIX Sangstat 公司；二氮嗪（Diazoxide，DE），5-羟基葵酸盐（5-HD）和二甲基亚砜 (DMSO)均为美国Sigma公司产品；DE使用前用DMSO溶解，其终浓度＜0.1％。
1.2 实验动物
雄性SD大鼠（体重250～300g）112只，由浙江省医科院实验动物中心提供。随机分为：⑴对照组：单纯Celsior液保存5h；⑵实验组：含30μmol/L DE的Celsior液保存5h；⑶拮抗组，含100μmol/L 5-HD和30μmol/L DE的Celsior液保存5h。前两组又以移植术后留取标本时间5min、1周、3个月不同分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，分别对应为短、中、长期。
1.3 实验模型的建立
(1)供体手术：2％戊巴比妥钠30mg/kg经腹腔注射麻醉，正中剪开颈部皮肤，分离暴露气管，切开插入16G管。进行机械通气，潮气量5ml，频率60次/min。然后胸部皮肤消毒，胸骨正中纵切口，剪开胸腔置冰盐水，显露心脏。分离所有进出心脏各血管并套线备用。静注肝素300IU/kg，2min后阻断主动脉，根部灌注4℃改良St.Thomas停搏液5～6ml。心脏迅速停搏、松弛、变白。将除无名动脉和右肺动脉外所有血管结扎并剪断；摘下供心经主动脉用4℃各保存液灌注，并冲洗掉残留血管内血液，修剪后置于各保存液中保存。(2)受体手术：麻醉后固定于实验台上，给予面罩吸氧1L/min。颈部皮肤消毒，右侧斜切口约2.5cm。游离右颈外静脉与右颈总动脉，分别套线备用。阻断右颈外静脉近心端，结扎远心端，靠近结扎处近心端剪断颈外静脉，套入自制Cuff管，将血管外翻于Cuff管上，并结扎固定。微血管夹阻断右颈总动脉近心端，同法Cuff管套扎备用。(3)移植手术：供心低温按要求保存时间后取出，冷盐水湿纱布覆盖供心置手术野，以防复温。先将受体颈总动脉套入供心无名动脉并结扎固定；同样方法将受体翻套后的右颈外静脉套入供心的右肺动脉并结扎固定。慢慢移去微血管夹，逐渐开放血流，10～30s内心脏自动恢复搏动，开始计时并观察记录。
1.4 检测及观察指标
(1)心肌细胞膜Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性的测定：采用定磷法，按试剂盒说明进行，酶活性用每克蛋白单位时间内催化ATP释放的无机磷量（Pi）表示，即μmolPi/mgProt/h。(2)心肌超微结构：中长期每组均留取小块心室肌组织，置入3％戊二醛溶液中，制备电镜标本，观察心肌纤维及线粒体结构变化。
1.5 统计学处理
数据用均数±标准差（x±s）表示，用SPSS统计软件。所有计量数据均经方差齐性和正态分布检验。组间差异采用方差分析和 SNK-q检验。
2 结果
实验Ⅰ、Ⅱ组细胞膜Na+-K+-ATPase和肌浆网Ca2+-ATPase活性均显著高于相应对照Ⅰ、Ⅱ组（P<0.05），而实验Ⅲ组和对照Ⅲ组差异无显著性（图1、2）。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组细胞膜Na+-K+-ATPase活性增高呈显著递减性减弱（P<0.05），Ⅰ组肌浆网Ca2+-ATPase活性显著高于Ⅱ、Ⅲ组，而Ⅱ组和Ⅲ组差异无显著性；对照组间比差异无显著性（图1、2）。拮抗组取消了实验组Ⅰ、Ⅱ组细胞膜Na+-K+-ATPase和肌浆网Ca2+-ATPase活性的增高，与对照组接近，差异无显著性（图1、2）。中长期各组均有良好的保护，心肌结构清晰，肌节清；线粒体肿胀不明显，嵴结构尚清楚，排列整齐；仅Ⅲ组偶有空泡变性（图3）。
3 讨论
Na+-K+-ATPase，又称钠泵，是一种广泛存在于高等真核生物细胞膜上的膜结合蛋白，对于其离子泵的功能已有深入研究，如维持心肌细胞的膜电位和细胞内外渗透压平衡，为细胞转运无机离子和营养物质及排泄代谢产物提供驱动力等作用。Ca2+-ATPase是参与维持细胞内Ca2+平衡的重要因素［１］。正常心肌组织中，细胞膜Na+-K+-ATPase和肌浆网Ca2+-ATPase所消耗能量占心肌总能量的34％左右［2］，因此两酶对心肌组织的能量代谢起着至关重要的作用。且两酶在调节胞浆Ca2+水平方面占有极其重要的地位，此两酶活性若改变，必将引起胞浆内离子浓度紊乱，尤其是Ca2+代谢的失调，从而产生心肌损伤及心功能异常等各种病理生理变化［3］。
本研究采用改良Heron法大鼠颈部异位心脏移植模型。在供心采取过程中，进行主动脉根部各保存液灌注冲洗残留血液，让心肌内完全充盈着保存液后再浸泡保存。若干小时后再移植至受体大鼠颈部，模拟临床心肌长时间冷缺血后再灌注的情况。实验结果显示：二氮嗪改善细胞膜Na+-K+-ATPase和肌浆网Ca2+-ATPase在心肌长期冷缺血期间活性的保存，在移植恢复血液供应后，两酶的活性在短期（5min）和中期（1周）仍显著增高，长期（3个月）时无明显增高。 心肌缺血主要是一种能量代谢的障碍过程［4］。心肌冷缺血期间，几乎完全依赖于有氧代谢产生ATP以供细胞生存及做功需要的心肌细胞，由于缺乏氧供致使ATP生成减少，能量代谢势必引起障碍［5］。而与能量代谢关系密切的细胞膜Na+-K+-ATPase和肌浆网Ca2+-ATPase活性也随之下降，进而在恢复血液灌注时细胞内离子浓度紊乱，形成代谢障碍的恶性循环。所以在心肌冷缺血期间，能更好地保存细胞膜Na+-K+-ATPase和肌浆网Ca2+-ATPase的活性，使其在得到血液重新灌注后，能快速更多地恢复活性参与各种代谢，以满足心肌各种工作的需要。此不失为一种减轻心肌缺血再灌注损伤的方法。本实验正是研究二氮嗪处理后Celsior液中长时间低温保存移植鼠心，对细胞膜Na+-K+-ATPase和肌浆网Ca2+-ATPase活性的保护作用，获得符合上述的结论。目前还发现二氮嗪对移植鼠心各时期（5min、1周、3个月）细胞膜Na+-K+-ATPase活性的增高作用呈显著递减性减弱，对肌浆网Ca2+-ATPase活性的增高亦呈递减性减弱，但无显著性。提示二氮嗪此作用具有一定的时限性，短期作用最强，中期顺势减弱。临床上，心脏移植的成功最关键是在恢复血液供应时心功能的状态。因此二氮嗪在短期的作用正符合临床需要，能有效地促进心脏移植初期心功能的恢复。
中长期各组电镜超微结构显示差异无显著：心肌结构清晰，肌节清；线粒体肿胀不明显，嵴结构尚清楚，排列整齐。可排除移植鼠心因排斥反应引起的各组数据的不可比性。5－HD是二氮嗪的特异性阻断剂。拮抗组与对照组间两酶的活性差异无显著性，提示了二氮嗪对细胞膜Na+-K+-ATPase和肌浆网Ca2+-ATPase活性存在保护作用。
综上所述，本研究进一步观察了二氮嗪对移植鼠心在长期冷缺血后再灌注期间，有更好地保存和提高细胞膜Na+-K+-ATPase和肌浆网Ca2+-ATPase的活性，维持心肌能量代谢更顺利的进行来发挥心肌保护作用。二氮嗪处理后Celsior液保存移植鼠心是否可相应延长时间仍安全有效，有待进一步研究探讨。
【】
1 Lompré AM, Anger M, Levitsky D. Sarco(endo)plasmic reticulum calcium pumps in the cardiovascular system: function and gene expression. J Mol Cell Cardiol， 1994，26(9):1109～1121.
2 Clausen T, Van Hardeveld C, Everts ME. Significance of cation transport in control of energy metabolism and thermogenesis. Physiol Rev. 1991，71(3):733～774.
3 Kim MS, Akera T. O2 free radicals: cause of ischemia-reperfusion injury to cardiac Na+-K+-ATPase. Am J Physiol， 1987，252(2 Pt 2):252～257.
4 Taegtmeyer H, King LM, Jones BE. Energy substrate metabolism, myocardial ischemia, and targets for pharmacotherapy. Am J Cardiol， 1998，82(5A):54～60.
