食道癌患者CD4+、CD25+、Foxp3+调节性T细胞的变化及意义

            作者：胡正军 王胜军 李媛 成军 孙长贵 钱丽丽 刘永林 陈益民 

【摘要】  ［目的］初步探讨CD4+CD25+Foxp3+调节性T 细胞在食道癌患者外周血中的变化及临床意义。［方法］59例食道癌患者，分为鳞癌组47例，腺癌组12例，另外30例健康志愿者为对照组，用流式细胞术分别检测外周血中CD4+、CD25+、Foxp3+T 细胞占CD4+T细胞的比例。［结果］食道癌初诊患者组CD4+、CD25+、Foxp3+T 细胞比例为(10.33±5.72) %，明显高于健康志愿者组(4.56±1.06) % (P<0.01)，而食道鳞癌组和食道腺癌组CD4+、CD25+、Foxp3+T 细胞比例没有明显差异。［结论］CD4+、CD25+、Foxp3+调节性T 细胞在食道癌初诊患者外周血中比例增加,可能是食道癌免疫抑制的一个重要原因。

【关键词】  食道癌；CD4+CD25+调节性T 细胞；叉状头/翅膀状螺旋转录因子

　　Abstract：［Objective］ To investigate the changes of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells (Tregs) in peripheral blood of patients with esophageal carcinoma and its possible clinical significance.［Methods］ The flow cytometry was used to evaluate the population of CD4+,CD25+,Foxp3+T cells in the peripheral blood of the patients with esophageal carcinoma before therapy and of the healthy donors.［Results］ The percentage of CD4+,CD25+,Foxp3+T cells of the esophageal carcinoma group before therapy was significantly higher than the healthy donors group (P<0.01)，but there is no difference in SC and AC.［Conclusion］ The population of CD4+,CD25+,Foxp3+T cells in peripheral blood of the esophageal carcinoma is significantly increased,suggesting that it might be one of the important reasons of immunosuppression in esophageal carcinoma.

　　Key words:esophageal carcinoma;CD4+,CD25+regulatory T cells;forkhead/ winged helix transcription factor
   
　　CD4+CD25+调节性T 细胞(Tregs) 是新型免疫抑制性调节细胞,在肿瘤免疫抑制及逃逸机制中起重要作用［1?2］。叉状头/翅膀状螺旋转录因子(Foxp3)是CD4+CD25+Tregs特异性分子标志物［3］,通过病毒载体将Foxp3基因被动地转移给无调节活性的CD4+CD25+细胞,可赋予其与Tregs相似的免疫调节活性。本文把Foxp3作为检测CD4+CD25+Tregs的指标,分析Tregs在食道癌初诊患者外周血中的比例,初步探讨CD4+CD25+Foxp3+Tregs在食道癌免疫抑制中的作用,为临床设计免疫方案提供。

　　1  材料和方法

　　1.1  临床病例  本组59例均系浙江省中肿瘤科病房住院和门诊简易病房的患者,均经入院检查及病理组织学检查诊断，经食道钡餐X线片、纤维胃镜及病理检查,证实为食道癌（鳞癌47例，腺癌12例），B 超、CT检查无肝、肺、脑等重要脏器转移。其中男41例,女18例,年龄51～69岁,平均61.4岁。对照组为我院体检健康者30例,男13例,女17例,年龄49～66岁,平均52.9岁。

　　1.2  主要试剂及仪器  人调节性T细胞检测试剂盒:其中主要包括FITC标记的抗人CD4 抗体,PerCP标记的抗人CD25抗体，PE标记的抗人Foxp3抗体,同型对照为PE标记的鼠抗人IgG2a免疫球蛋白,均为美国eBioscience公司产品。人淋巴细胞分离液,上海华精高科技有限公司。高速台式离心机:eppendorf centrifuge 5417R(低温) (美国)。流式细胞仪(FCM)：美国Becton Dickinson公司生产,产品型号:FACSCalibur。

　　1.3  CD4+CD25+Foxp3+Treg含量检测方法  所有观察对象均于清晨空腹抽取静脉血2ml,EDTA 抗凝。用人淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC),每管加100μl 上述PBMC(约1×106个细胞),应用荧光直接标记法及流式细胞仪检测PBMC膜表面CD4、CD25及胞质Foxp3。取20μl不同荧光标记的CD4/ CD25单克隆抗体混合液,4℃避光孵育30 min,用预冷的PBS洗涤后悬浮细胞,每管加1 ml新鲜制备的固定/透化剂,4℃避光孵育45 min,离心弃上清加预冷的PBS洗涤,用2 ml透化缓冲液洗涤细胞两次,用2μl (2 %)正常小鼠血清封闭15 min后加20μl Foxp3抗体,4℃避光孵育30 min,用2 ml透化缓冲液洗涤细胞2次,加入适当体积FCM染色缓冲液悬浮细胞,流式细胞仪检测,以CD4+T细胞设门，EXPO32软件分析数据,记录阳性细胞百分率,减去非特异对照值。

　　1.4  统计学分析  采用SPSS 12.0 软件进行分析,应用单因素方差分析及t检验方法比较各组间差异,数据用(x±s) 表示,P<0.05为差异有显著意义。

　　2  结果
   
　　食道癌初诊组CD4+CD25+Foxp3+T 细胞占CD4+T细胞群体比例(10.33±5.72) %明显高于健康志愿者组(4.56±1.06) % (P<0.01)。47例食道鳞癌组CD4+CD25+Foxp3+T 细胞占CD4+T细胞群体比例(10.28±5.22)与12例食道腺癌组(10.50±5.85)相比无明显差异（P>0.05），但都明显高于健康志愿者组(4.56±1.06) % (P<0.01)，见表1。

　　3  讨论
   
　　CD4+CD25+Tregs 是近年来发现的一种新型的免疫抑制细胞,来源于胸腺,外周血中持续性抗原刺激及IL?10、TGF?β等细胞因子条件下诱导也可产生［4?6］。近年来许多学者对CD4+CD25+Tregs在肿瘤免疫方面大量的研究证实,肺癌、卵巢癌、胃肠道肿瘤、乳腺癌、慢性淋巴细胞白血病等患者外周血或肿瘤局部CD4+CD25+Tregs 成分增加,提示肿瘤患者可能存在天然的免疫反应,并具有促进机体免疫抑制的作用。
   
　　Foxp3 是CD4+CD25+Tregs 特异性标志,与其生长发育和功能维持密切相关。本研究结果表明，食道癌初诊组CD4+CD25+Foxp3+T 细胞占CD4+T 细胞群体比例(10.33±5.72) %明显高于健康志愿者组(4.56±1.06) %，但食道鳞癌组和食道腺癌组无明显差异，提示CD4+CD25+Foxp3+Tregs 在食道癌患者外周血中的表达较正常人明显增加，这可能是食道癌患者免疫功能下降的一个重要原因。动物实验证实，直接去除CD4+CD25+Tregs 或通过CD25单克隆抗体、CTLA4 单克隆抗体、GIT?REGS 阻断CD4+CD25+Tregs 抑制功能都可产生有效的肿瘤免疫,抑制肿瘤的生长［7］，这些与我们之前研究结果相符。因此,我们认为食道癌患者体内过度表达的CD4+CD25+Foxp3+Tregs 有可能也抑制了机体对癌细胞的有效攻击,从而导致免疫逃逸。提示下调CD4+CD25+Treg 数量或功能将有助于提高机体抗肿瘤免疫,减轻肿瘤负荷,这些研究将为以Treg 为靶标的免疫调控策略提供有益的启示。

【】
  　［1］ Klein L.Visualizing the course of antigen?specific CD8 and CD4 T cell responses to a growing tumor［J］.Eur J Immunol，2003，33:806?814.

　　［2］ Wang HY，Lee DA.Tumor?specific human CD4+regulatory T cells and their ligands: implications for immunotherapy r［J］.Immunity，2004，20:107?118.

　　［3］ Sakaguchi S.Naturally arising Foxp3?expressing CD25+CD4+regulatory T cells in immunological tolerance to self and non?self r［J］.Nat Immunol，2005，6(4):345?352.

　　［4］ Walker LS，Chodos A，Eggena M，et al.Antigen?dependent proliferation of CD4+CD25+Regulatory T cells in vivo r［J］.J Exp Med，2003，198(2):249?258.

　　［5］ Vigouroux S，Yvon E，Biagi E，et al.Antigen?induced regulatory T cells r［J］.Blood，2004，104(1): 26?33.

　　［6］ Muller AJ，Scherle PA.Targeting the mechanisms of tumoral immune tolerance with small?molecule inhitors r［J］.Nat Rev Cancer，2006，6(8):613?625.

　　［7］ 胡正军，王胜军，朱燕萍，等.mGITRL真核表达质粒的构建及其在Lewis细胞中的表达［J］.江苏大学学报（医学版），2008，18(2)： 107?110.