白藜芦醇对缺氧环境中鼻咽癌细胞株CNE2的化疗增敏作用
作者：权芳, 张少强, 白艳霞, 姚小宝, 李宏慧, 于良, 潘承恩
【摘要】 目的：观察缺氧环境下白藜芦醇（resveratrol，Res）提高人鼻咽癌细胞株CNE2对化疗药物敏感性的作用并探讨其机制。方法：将不同浓度白藜芦醇加入化疗药物干预过的CNE2中，低氧培养48 h，甲基噻唑基四唑法检测CNE2中白藜芦醇对化疗药物的逆转倍数，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，应用反转录聚合酶链式反应和蛋白质印迹法检测CNE2细胞中多药耐药相关基因1(multidrug resistance gene 1，mdr1)、多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance?associated protein 1，MRP1)和缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF?1α）mRNA和蛋白水平的表达变化。结果：缺氧环境下白藜芦醇对化疗药物具有协同增效作用，200 μmol/L白藜芦醇对紫杉醇的逆转倍数为2.58。25、50、100和200 μmol/L白藜芦醇与紫杉醇合用，使紫杉醇诱导的CNE2细胞凋亡增加，且表现出明显的浓度依赖效应。此外随着白藜芦醇浓度的增加，mdr1、MRP1和HIF?1α的表达显著降低，加用白藜芦醇组与不加白藜芦醇组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。结论：白藜芦醇可以通过下调核转录因子HIF?1α及多药耐药相关基因mdr1、MRP1的表达提高缺氧环境中鼻咽癌细胞株CNE2对化疗药物的敏感性。
【关键词】 白藜芦醇; 化疗增敏; 缺氧; 鼻咽癌
Methods: Human CNE2 nasopharyngeal carcinoma cell line was cultured under hypoxic conditions (37 ℃, 5% CO2, 2% O2) in vitro. The cultured cells were treated with different concentrations of resveratrol for 48 h. Reversal fold (RF) of reseratrol to chemotherapeutic drugs in CNE2 cells was measured by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay. Apoptotic rate of CNE2 cells was observed by flow cytometry. Reverse transcription?polymerase chain reaction (RT?PCR) method and Western blotting were used to investigate the expressions of multidrug resistance gene 1 (mdr1), multidrug resistance?associated protein 1 (MRP1) and hypoxia inducible factor 1α (HIF?1α) in CNE2 cells.
Results: Resveratrol combined with chemotherapeutics produced a synergistic effect. The RF of 200 μmol/L resveratrol to paclitaxel was 2.58. Combined with paclitaxel, 25, 50, 100 and 200 μmol/L of resveratrol increased the apoptotic rate of CNE2 cells from (22.14±1.09)% to (23.24±1.37)%, (27.57±2.01)%, and (30.36±2.31)%, respectively. Resveratrol could down?regulate the expressions of HIF?1α, mdr1 and MRP1 significantly. After being treated with resveratrol at different concentrations separately, the expressions of HIF?1α, mdr1 and MRP1 in CNE2 cells decreased significantly as compared with paclitaxel alone or paclitaxel plus verapamil (P<0.01).
Conclusion: Resveratrol can enhance the sensitivity of CNE2 cells to chemotherapeutic drugs under hypoxia. The potential mechanism is partly attributed to inhibiting the gene expressions of HIF?1α, mdr1 and MRP1.
Keywords: resveratrol; chemotherapy sensitization; hypoxia; nasopharyngeal carcinoma
鼻咽癌是南部及东南亚地区最常见的恶性肿瘤之一。实体瘤内存在的大量对射线敏感性下降和化疗药物耐药的乏氧细胞，是肿瘤放、化疗失败，肿瘤复发和再生长的根源。深入探讨鼻咽癌乏氧细胞耐药产生的机制，寻找有效增敏剂或增敏方法已成为当前临床的热点课题。白藜芦醇（resveratrol，Res）是广泛存在于葡萄、花生和多种传统中药中的一种多酚类化合物，具有降血脂，抗炎，抗氧化，抑制肿瘤细胞增殖、转移和促进凋亡等生物学功能，是近年中西医结合领域的一个研究热点。本实验室研究发现白藜芦醇对多药耐药的KBv200细胞具有化疗增敏作用［1］。本研究将在前期实验基础上，探讨Res对缺氧条件下鼻咽癌细胞株CNE2细胞的化疗增敏作用并通过紫杉醇研究其机制。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器 三气培养箱(NU4950型)，美国NUAIRE公司产品；荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)仪(7000型)，美国ABI公司产品；GIS凝胶成像系统，上海天能公司产品；FACsort流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司产品。白藜芦醇、紫杉醇和四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT），购自美国Sigma公司；顺铂，购自香港科鼎药业；5?氟尿嘧啶，购自浙江海正药业股份有限公司；TRIzol试剂、SupperScript逆转录试剂盒、PCR试剂盒、兔抗人磷酸化缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor?1alpha，HIF?1α）多克隆抗体、鼠抗人P?糖蛋白（P?glycoprotein，P?GP）单克隆抗体、鼠抗人多药耐药相关基因1(multidrug resistance gene 1，mdr1)单克隆抗体、鼠抗人多药耐药相关蛋白1（mulidrug resistance?associated protein 1，MRP1）单克隆抗体，购自晶美生物工程有限公司；AnnexinⅤ?异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡试剂盒，购自美国Oncogene公司。
1.2 MTT法检测白藜芦醇对缺氧环境中CNE2的化疗增敏作用 人鼻咽癌细胞CNE2，购自美国菌种保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）细胞库。CNE2细胞培养在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液内，置37 ℃，含5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养。每天观察细胞生长情况，2～3 d换液一次。当细胞生长达到铺满70%～80%时，以0.25%的胰蛋白酶?0.03% EDTA溶液消化，通常按照1∶3～5的比例传代，每周传代两次，当细胞传至8～10代时进入实验。
1.2.1 确定增敏的药物浓度 收集对数生长期的CNE2细胞制成单细胞悬液(1×106个/mL)，接种于96孔板，每孔100 μL。培养24 h后加入25、50、100、200、300 μmol/L白藜芦醇，另设不加药物的对照组及不含细胞的空白组，共7组，每组设5个重复孔，加药后置于三气培养箱中低氧培养（2% O2，5% CO2，93% N2）。培养48 h后MTT方法检测，并各浓度的增殖抑制率。绘制细胞增殖抑制曲线，选取抑制率≤20%的低细胞毒性或无细胞毒性浓度作为增敏浓度。实验重复4次。
1.2.2 逆转倍数的测定 按上法接种细胞，培养24 h后加入白藜芦醇及化疗药物。白藜芦醇为上述实验中确定的增敏浓度，化疗药物为紫杉醇，顺铂及5?氟尿嘧啶3种，均按1∶10逐级稀释的方式在10－4～10－9 mol/L间分6个浓度组，另设对照组及空白组，每组设5个重复孔。加药后培养48 h，测570 nm吸光度值，计算细胞存活率，参照［2］确定半抑制浓度（50% inhibiting concentration，IC50），实验重复3次。按以下公式计算逆转倍数（reversal fold，RF）: RF=IC50A/IC50B。其中IC50A和IC50B分别为缺氧下白藜芦醇作用前后CNE2细胞对化疗药物的IC50值。
1.3 实验分组 确定白藜芦醇IC50后，将生长状态良好的人鼻咽癌细胞系CNE2细胞常氧培养24 h后分6组。（1）紫杉醇8 nmol/L（设为不加白藜芦醇的阴性对照组）；（2）紫杉醇8 nmol/L+维拉帕米10 μmol/L（阳性对照组）；（3）紫杉醇8 nmol/L+25 μmol/L白藜芦醇；（4）紫杉醇8 nmol/L+50 μmol/L白藜芦醇；（5）紫杉醇8 nmol/L+100 μmol/L白藜芦醇；（6）紫杉醇8 nmol/L+200 μmol/L白藜芦醇。加药后置于三气培养箱中低氧(2% O2，5% CO2，93% N2)培养48 h。实验重复5次。
1.4 AnnexinⅤ?FITC/PI双标记法检测CNE2细胞凋亡 离心收集6组细胞，按照AnnexiⅤ?FITC/PI试剂盒说明书处理待测细胞。用4 ℃预冷的PBS洗细胞2次，结合缓冲液去离子水1∶4稀释。用250 μL稀释的结合缓冲液重新悬浮细胞，并使其浓度为1×106/mL。取100 μL细胞悬液于5 mL流式管中，加入5 μL AnnexinⅤ?FITC和10 μL 20 μg/mL PI溶液。混匀后于室温避光孵育15 min。在反应管中加入400 μL PBS，流式细胞仪检测。所有数据经CellQuest 1.2软件分析。
1.5 RT?PCR检测mor1、MRP1和HIF?1α mRNA的表达 按TRIzol操作说明，分别提取6组CNE2细胞总RNA，紫外分光光度计定量，调整RNA质量浓度为1 g/L。RNA样品经反转录反应合成cDNA第一链，然后进行PCR扩增。经预实验，将逆转录的cDNA稀释10倍为模板。引物设计mdr1（473 bp）正义引物：5'?CTG TCA GTG TAT TTT CAA TGT TTC G?3'；反义引物：5'?AAT TTT GTC ACC AAT TCC TTC ATT A?3'。MRP1（440 bp）正义引物：5'?TCT ACT TCT TCG TCC AGA GGT TCT A?3'；反义引物5'?CTC AGT CTC TGA ATA CTC CTT GAG C?3'。HIF?1α（359 bp）正义引物；5'?CCA TCT CCT ACC CAC ATA CAT AAA G?3'；反义引物：5'?CTA GAT TTG CAT CCT TTT ACA AGT T?3'。β?actin（160 bp)正义引物：5'?AGA ACA TCA TCC ATG CAT CCA?3'；反义引物：5'?GCC TGC TTC ACC ACC TTC TTG?3'。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。总反应体系为25 μL：10×Reaction buffer（MgCl2 15 mmol/L）2.5 μL，dNTP Mix（10 mmol/L）1 μL，5'和3'引物（10 μmol/L）各0.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 19 μL。反应条件：94 ℃变性5 min，94 ℃变性30 s、退火40 s，35次循环。退火温度各个引物不同（mdr1 58 ℃，HIF?1α 55 ℃，MRP?1 62 ℃，β?actin 52 ℃）、72 ℃延伸50 s，35次循环后72 ℃再延伸10 min。扩增完成后取10 μL PCR产物1.5%琼脂糖凝胶，溴化乙锭染色，60 V电压电泳40 min，全自动凝胶成像系统对结果进行分析并拍照。RT?PCR反应结束后在ABI7000软件系统中调整基线或阈值，凝胶成像系统扫描记录，mRNA表达以灰度值表示，以目的基因mRNA/β?actin mRNA比值来表示mRNA的相对表达。
1.6 蛋白印迹法检测mdr1、MRP1和HIF?1α蛋白的表达 收集待测6组CNE2细胞，TRIzol一步法抽提细胞总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白质含量。50 μg细胞蛋白经十二烷基璜酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法电转移至硝酸纤维素膜，丽春红染色证实转移成功，去脂奶粉封闭1 h后，分别加入1︰500稀释的兔抗人多克隆抗体HIF?1α或鼠抗人mdr1单克隆抗体或鼠抗人MRP1单克隆抗体，4 ℃过夜。次日用PBS洗涤后置于稀释的偶联有辣根过氧化物酶标记的二抗（1︰2 000）中，化学发光法显色，拍片。蛋白质印迹化学发光结果经机扫描后，GIS凝胶成像系统计算净面积值代表蛋白表达量。
1.7 统计学方法 所有统计学分析采用SPSS 10.0软件包，各组数据符合正态分布，采用x±s表示；数据组间差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD?t检验或Post Hoc检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 白藜芦醇对CNE2的增敏作用 25、50、100、200和300 μmol/L的白藜芦醇作用48 h后，对CNE2的增殖抑制率分别为(2.21±1.45)%、(3.27±1.12)%、(5.58±1.39)%、(11.72±1.98)%、(21.04±2.68)%。选择细胞增殖抑制率≤20%的25、50、100、200 μmol/L白藜芦醇为化疗增敏浓度，加药后48 h测IC50值，计算25、50、100、200 μmol/L白藜芦醇对上述3种化疗药物的逆转倍数分别为（1.14、1.33、1.89、2.58）、（1.18、1.34、1.52、1.75）、（1.07、1.24、1.39、1.56），表现出明显的浓度依赖效应。见表1。
2.2 缺氧环境中白藜芦醇对紫杉醇诱导的CNE2细胞凋亡的影响 缺氧培养下，单因素方差分析显示组间差异有统计学意义(F=36.633，P<0.01)。提示缺氧时白藜芦醇能明显增强紫杉醇的对缺氧细胞的毒性，引起细胞凋亡，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。见表2和图1。
表1 缺氧环境中白藜芦醇调节CNE2细胞对化疗药物的敏感性（略）
Table 1 Effects of resveratrol in modulating the sensitivity of CNE2 cells to cytotoxic drugs under hypoxia
Res, resveratrol; RF, reversal fold.
表2 流式细胞仪检测缺氧环境下白藜芦醇和紫杉醇诱导的CNE2细胞凋亡（略）
Table 2 Apoptosis of CNE2 cells induced by paclitaxel plus resverarol under hypoxia observed by flow cytometry
**P<0.01, vs paclitaxel group; △△P<0.01, vs paclitaxel plus 10 μmol/L verapamil group; ▲P<0.05, ▲▲P<0.01, vs paclitaxel plus 200 μmol/L Res group.
图1 流式细胞仪检测缺氧环境下白藜芦醇和紫杉醇诱导的CNE2细胞凋亡（略）
Figure 1 Apoptosis of CNE2 cells induced by paclitaxel plus resverarol under hypoxia observed by flow cytometry
CNE2 cells were incubated with 8 nmol/L paclitaxel in the presence of various concentrations of resveratrol or 10 μmol/L verapamil for 48 h under hypoxia. The rate of apoptosis was measured by using flow cytometry. A: Paclitaxel; B: Paclitaxel plus verapamil; C?F: Paclitaxel plus 25, 50, 100 and 200 μmol/L of resveratrol, respectively.
2.3 白藜芦醇对紫杉醇诱导的乏氧CNE2细胞mdr1、MRP1及HIF?1α mRNA表达的影响 缺氧状态下，随白藜芦醇作用浓度的升高，MRP1、mdr1及HIF?1α mRNA表达水平明显降低，与单用紫杉醇、紫杉醇联合维拉帕米比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。见表3和图2。
2.4 白藜芦醇对紫杉醇诱导的乏氧CNE2细胞多药耐药蛋白及HIF?1α表达的影响 蛋白印迹法检测结果显示，在内参照β?actin条带基本相同的条件下，随白藜芦醇作用浓度的升高，MRP1、P?gp及HIF?1α的蛋白表达水平明显降低，与单用紫杉醇、紫杉醇联合维拉帕米比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图3和表4。
表3 白藜芦醇作用后CNE2细胞mdr1、 MRP1及HIF?1α mRNA的表达（略）
Table 3 Effects of resveratrol on expressions of mdr1, MPR1 and HIF?1α mRNAs in CNE2 cells
**P<0.01, vs paclitaxel group; △△P<0.01, vs paclitaxel plus 10 μmol/L verapamil group; ▲▲P<0.01, vs paclitaxel plus 200 μmol/L Res group.
图2 RT?PCR检测缺氧环境下白藜芦醇和紫杉醇诱导的CNE2细胞mdr1、MRP1及HIF?1α mRNA表达（略）
Figure 2 Expressions of mdr1, MPR1 and HIF?1α mRNAs in CNE2 cells induced by paclitaxel plus resverarol under hypoxia observed by RT?PCR
图3 蛋白印迹法检测缺氧环境下白藜芦醇和紫杉醇诱导的CNE2细胞P?gp、MRP1及HIF?1α蛋白表达（略）
Figure 3 Expressions of P?gp, MRP1 and HIF?1α proteins in CNE2 cells induced by paclitaxel plus resveratrol under
hypoxia observed by Western blotting
表4 白藜芦醇作用后CNE2细胞P?gp、MRP1及HIF?1α蛋白的表达（略）
Table 4 Effects of resveratrol on expressions of P?gp, MRP1 and HIF?1α proteins in CNE2 cells
*P<0.05, **P<0.01, vs paclitaxel group; △△P<0.01, vs paclitaxel 10 μmol/L plus verapamil group; ▲▲P<0.01, vs paclitaxel plus 200 μmol/L Res group.
3 讨论
近年来，大量临床研究显示放射联合化学药物治疗能取得更高的治愈率，但由于恶性肿瘤细胞生长迅速，使得肿瘤组织血流灌注不均匀，造成肿瘤内局部组织的急慢性缺氧，并引起肿瘤细胞发生一系列生物学改变［3，4］。实体瘤内存在的乏氧细胞可能就是肿瘤放化疗失败、肿瘤复发和再生长的根源。针对相对特异的缺氧微环境，寻找缺氧细胞化疗增敏剂成为关注热点。本研究小组的前期实验研究发现缺氧通过诱导多药耐药相关基因的表达，降低肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。本研究探讨白藜芦醇对乏氧环境下鼻咽癌细胞的化疗增敏作用。
乏氧导致的肿瘤细胞凋亡能力下降使某些化疗药物失去疗效而引起肿瘤耐药［5］。寻找低毒和不良反应少的化疗增敏剂对提高治疗效果有重要意义。白藜芦醇即非黄酮类多酚化合物3,5,4'三羟基二苯乙烯(3,5,4'?tri?hydroxystilbene)，是植物为抵抗外界刺激如紫外线、真菌、病毒感染或机械损伤而产生的一种植物抗毒素(phytoalexin)。实验结果显示，非细胞毒性剂量的白藜芦醇能够明显提高紫杉醇、顺铂和氟尿嘧啶对CNE2的细胞毒性作用，增敏作用具有浓度依赖性，提示白藜芦醇具有化疗增敏作用。白藜芦醇如何提高乏氧鼻咽癌细胞CNE2对化疗药物的敏感性目前尚不清楚。大多数化疗药物通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗癌作用。本实验结果显示，非细胞毒性剂量的白藜芦醇对紫杉醇诱导的CNE2细胞凋亡有显著增强作用，详细机制有待进一步研究。
肿瘤耐药的形成机制较为复杂，已知P?gp［6］和MRP［7］等与耐药有关。P?gp是一种能量依赖性的膜转运蛋白，可将摄入细胞内的药物转运出细胞，降低细胞内药物的有效浓度。因此P?gp的过度表达与肿瘤细胞的固有耐药性有关。MRP1是一种非P?gp的膜转运蛋白，其耐药机制也是通过能量依赖性的药物泵出作用，参与药物进入细胞器或直接影响药物在细胞内的重新分布。HIF?1α是细胞缺氧状态下最重要的核转录因子，可在转录水平调控诸多靶基因的表达，而引起一系列细胞对缺氧的反应［8］。在本研究中白藜芦醇能显著降低HIF?1α和多药耐药相关基因mdr1、MRP1的表达，并具有浓度依赖性。提示缺氧环境中白藜芦醇可以通过下调多药耐药基因从而提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，至于是通过作用于核转录因子HIF?1α以调节多药耐药基因及其蛋白的表达，抑或是同时作用于HIF?1α和多药耐药相关基因mdr1、MRP1，其中机制尚须进一步研究。
白藜芦醇可以提高CNE2细胞对紫杉醇的敏感性，提示白藜芦醇有可能被用作化疗增敏剂，提高或实现对鼻咽癌的有效化疗。
【】
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