痛泻要方抑制大鼠离体结肠平滑肌收缩的钙动员机制
作者：袁建业, 谢建群, 吴大正, 郑昱, 潘相学, 费晓燕, 徐海珍
【摘要】 目的：从影响钙动员角度，探讨痛泻要方抑制大鼠结肠平滑肌收缩的作用机制。方法：应用离体平滑肌张力测定方法，观察痛泻要方对乙酰胆碱（acetylcholine, ACh）、氯化钾（KCl）和细胞内钙库耗竭后细胞外Ca2+内流引起的大鼠结肠平滑肌收缩的影响。结果：痛泻要方能够抑制KCl和细胞内钙库耗竭后细胞外Ca2+内流引起的大鼠结肠平滑肌收缩，并呈浓度依赖性。3 000 μg/mL 痛泻要方还能抑制ACh引起的第二收缩时相张力，与不加药的对照组（Krebs液）比较，差异有统计学意义（P<0.01）；痛泻要方对ACh引起的第一收缩时相张力无明显影响。结论：痛泻要方主要通过抑制胞外Ca2+内流来抑制大鼠结肠平滑肌的收缩，可能涉及到阻断电压门控钙通道、钙库调控性钙通道和受体操纵性钙通道，但不影响ACh引起的胞内Ca2+释放。
【关键词】 痛泻要方; 结肠; 平滑肌; 钙动员; 大鼠
Objective: To study the relationship between the inhibitory effects of Tongxie Yaofang, a compound traditional Chinese herbal medicine, on the contraction of the colonic smooth muscle isolated from rats and calcium mobilization.
Methods: By measuring the tension of the isolated colonic smooth muscle strips, the inhibitory effects of Tongxie Yaofang on the contraction induced by acetylcholine (ACh), KCl and exhausting Ca2+ of internal calcium store were assessed respectively.
Results: Tongxie Yaofang could concentration?dependently inhibit the contraction of isolated rat colonic smooth muscle strips induced by KCl and exhausting the Ca2+ of internal calcium store. Tongxie Yaofang could also inhibit the tension of the second contractile phase induced by ACh (P<0.01, vs control), but had no influence on the first contractile phase.
Conclusion: Tongxie Yaofang can inhibit the contraction of isolated rat colonic smooth muscle strips mainly by preventing the influx of extracellular Ca2+, which may be associated with blocking voltage?dependent channel, store?operated channel and receptor?operated channel, but not by preventing the release of internal Ca2+ from calcium store.
Keywords: Tongxie Yaofang; colon; smooth muscle; calcium mobilization; rats
痛泻要方是中医“痛泻”证的名方，最早见于《丹溪心法·卷二》［1］。许多临床研究报道以痛泻要方为基础方治疗腹泻型肠易激综合征取得良好疗效［2，3］。药理实验表明，痛泻要方对大鼠、兔等实验动物的肠平滑肌收缩具有抑制作用［4，5］，但具体作用机制尚不完全清楚。本实验从钙动员角度探讨痛泻要方抑制大鼠离体结肠平滑肌收缩的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物 18只健康成年SD大鼠，雄性，清洁级，体质量200～300 g，购自院上海实验动物中心，动物使用许可证号为SYXK（沪）2007?0005，饲养在上海中医药大学实验动物中心，实验前禁食24 h，不禁水。
1.2 药物与试剂 痛泻要方（由白术、白芍、陈皮、防风组成），生药饮片一次性购自上海华宇药业有限公司；乙酰胆碱（acetylcholine, ACh），购自Sigma公司（批号为97H2649）；EGTA（ethylene glycol?bis(β?aminoethylether)?N,N,N',N'?tetraacetic acid），购自Sigma公司（批号为E?4378）；毒胡萝卜内酯（thapsigargin），购自Sigma公司（批号为T?9033）；Krebs液（NaCl 115 mmol/L、NaHCO3 25 mmol/L、KCl 2.4 mmol/L、KH2PO4 0.6 mmol/L、CaCl2 1.2 mmol/L、MgCl2 1.2 mmol/L、glucose 10 mmol/L），除NaHCO3为Sigma公司产品外，其余所用试剂均为国产分析纯。无钙Krebs液，即Krebs液去掉CaCl2。
1.3 仪器设备 PowerLab/4SP数据处理与分析系统、MLT02021D型张力传感器，购自澳大利亚ADI公司；501C型超级恒温水浴箱，购自上海实验仪器厂；电热恒温水温箱，购自上海医疗器械五厂；自制的离体张力测定灌流系统。
1.4 痛泻要方的制备 按比例（白术︰白芍︰陈皮︰防风=3︰2︰1.5︰1）称取一定量的饮片，加8倍体积的水，煎煮3次，每次1 h，合并3次水煎液过80目筛，然后将滤液浓缩至生药含量为1～2 g/mL。加入乙醇使乙醇浓度达90％，静置过夜，取上清液，用旋转蒸发仪回收乙醇后将药液置入真空干燥箱内干燥，并研末装入密封袋内备用。1 g生药得到0.105 g提取物。实验时用Krebs液或无钙Krebs液配制成所需浓度的溶液。
1.5 实验内容与方法
1.5.1 离体结肠平滑肌标本制备 参照方法［6］。将大鼠用木棒击头致昏后，迅速沿腹中线打开腹腔，于距肛门3～8 cm处剪取一段结肠，放入盛有4 ℃ Krebs液、底部铺有硅胶的培养皿中，并持续通以95％ O2＋5％ CO2的混合气体。用眼科剪小心去除肠管上的附带组织后，沿肠系膜一侧剪开洗净，黏膜层朝上固定在培养皿底部。用精细镊子将黏膜层及黏膜下层组织剥除，得到完整的平滑肌片。沿纵行肌纤维的走向剪成2 mm×8 mm的肌条标本，并在肌条两端分别用5?0号医用丝线扎牢。将制备好的标本移入含有37 ℃ Krebs液并持续通以95％ O2＋5％ CO2混合气体的恒温浴槽中，浴槽内溶液体积固定为10 mL。标本一端固定在浴槽底部，另一端通过张力换能器与生理记录仪相连。标本的初始负荷为0.5 g。每15分钟更换一次新鲜的Krebs液，平衡60 min后开始实验。
1.5.2 高钾引起的肌条收缩实验 每次实验时从同一只大鼠的结肠上剪取制备两个平滑肌标本，并分为痛泻要方组和空白对照组。标本平衡60 min后，浴槽内加入100 mmol/L KCl（终浓度，下同）引起肌条收缩。待收缩反应稳定后，痛泻要方组按累积加药法加入用Krebs液配制的痛泻要方溶液，使浴槽内的痛泻要方终浓度分别为3、10、30、100、300、1 000、3 000、10 000 μg/mL（生药浓度，下同），每5分钟增加一个浓度。以加药前后张力变化［（加痛泻要方后的张力值－基础张力值）/（加痛泻要方前的张力值－基础张力值）所得的百分数］作为观测指标，观察痛泻要方对KCl引起的肌条收缩的抑制作用。空白对照组用同体积的Krebs液代替痛泻要方溶液，其余操作与痛泻要方组相同，并取对应时间的张力值仿照痛泻要方组的方法得到百分数。以上实验用6只不同的大鼠重复6次。
1.5.3 细胞内钙库耗竭后细胞外Ca2+内流引起的肌条收缩实验 每次实验时从同一只大鼠的结肠上剪取制备两个平滑肌标本，并分为痛泻要方组和空白对照组。标本平衡60 min后，将Krebs液换成无钙Krebs液，并加入1 μmol/L thapsigargin和1 mmol/L EGTA孵育30 min以耗竭平滑肌细胞内钙库中的Ca2+，随后将溶液置换为2.5 mmol/L Krebs液引起肌条收缩。待收缩反应稳定后，痛泻要方组按累积加药法加入用Krebs液配制的痛泻要方溶液，加药和取值计算方法同1.5.1。空白对照组用同体积的Krebs液代替痛泻要方溶液，其余操作与痛泻要方组相同。以上实验用6只不同的大鼠重复6次。
1.5.4 ACh引起的肌条收缩实验 每次实验时从同一只大鼠的结肠上剪取制备4个平滑肌标本，并分为小、中、大剂量痛泻要方组和空白对照组。标本平衡60 min后，在浴槽内加入10－4 mol/L ACh引起肌条收缩，10 min后洗脱，重新平衡至肌条张力恢复到基线水平并出现稳定的自发节律后，小、中、大剂量痛泻要方组分别加入Krebs液配制的浓度为300、1 000、3 000 μg/mL的痛泻要方溶液孵育15 min；然后将Krebs液换成无钙Krebs液（连续用无钙Krebs液洗3次，并在最后一次洗后加入用无钙Krebs液配制的痛泻要方溶液，浓度与换液前相同），随即再次加入10－4 mol/L ACh，此时引起肌条瞬时收缩，为第一时相，是依赖于内钙的释放；待收缩消失后加入原水平（1.2 mmol/L）的Ca2+又可引起肌条持续性收缩，为第二时相，是外钙内流的结果。取第1次ACh增加的张力值作为参照值，取第2次ACh在无钙Krebs液中增加的张力值（第一时相）和复钙后增加的张力值（第二时相）分别作为效应值，以效应值/参照值所得的百分数作为观察指标，观察痛泻要方对ACh引起两个收缩时相的影响。空白对照组分别用同体积的Krebs液和无钙Krebs液代替痛泻要方溶液，其余操作与痛泻要方组相同。以上实验用6只不同的大鼠重复6次。
1.6 统计学方法 计量资料数据以x±s表示。运用GraphPad Prism 4软件对数据进行统计分析、作图。两组数据的比较采用Student?t检验，多组数据间比较采用单因素方差分析进行检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 痛泻要方对高钾引起的肌条收缩的影响 100 mmol/L KCl引起肌条张力增高，且能维持在一较稳定水平，加Krebs液后无明显变化。痛泻要方浓度依赖性地降低KCl增加的肌条张力，当浓度加至1 000 μg/mL时，痛泻要方组的肌条张力下降水平与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。在痛泻要方浓度为10 000 μg/mL时，肌条张力降至加痛泻要方前的35％左右。说明痛泻要方能抑制KCl引起的肌条收缩。见图1。
2.2 痛泻要方对细胞内钙库耗竭后细胞外Ca2+内流引起的肌条收缩的影响 细胞内钙库耗竭后，外钙内流引起的肌条收缩表现为较稳定的张力增加，增加的幅度远比KCl诱发的低。加入痛泻要方或Krebs液后，前者肌条张力迅速下降，而后者只是略有下降。当痛泻要方浓度为1 000 μg/mL时，痛泻要方组的肌条张力下降水平与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。当痛泻要方浓度为10 000 μg/mL时，几乎完全抑制了肌条收缩。说明痛泻要方可以抑制细胞内钙库耗竭后Ca2+内流引起的肌条收缩。见图2。
2.3 痛泻要方对ACh引起两个收缩时相的影响 经3 000 μg/mL提取物孵育后，ACh引起的第二收缩时相（即复钙后）增加的张力低于对照组（P<0.01）；而ACh引起的第一收缩时相（即在无钙Krebs液中）增加的张力与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；经300和1 000 μg/mL的痛泻要方提取物孵育后，ACh在无钙Krebs液中增加的张力及复钙后增加的张力与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
图1 痛泻要方对KCl引起的肌条收缩的抑制作用（略）
Figure 1 Inhibitory effects of Tongxie Yaofang on contraction of muscle strips induced by KCl Data were represented as x±s. n=6. **P<0.01, vs control.
图2 痛泻要方对细胞内钙库耗竭后细胞外Ca2+内流引起的收缩的抑制作用（略）
Figure 2 Inhibitory effects of Tongxie Yaofang on contraction of muscle strips induced by exhausting Ca2+ of internal calcium store
Data were represented as x±s. n=6. **P<0.01, vs control.
表1 痛泻要方对ACh引起的两个收缩时相的影响（略）
Table 1 Effects of Tongxie Yaofang on two phases of the contraction induced by ACh
**P<0.01, vs Krebs group.
3 讨论
Ca2+在介导平滑肌收缩反应中起核心作用。平滑肌细胞的收缩依赖于胞浆中游离Ca2+浓度（［Ca2+］i）的升高。［Ca2+］i的增加来源于细胞外液Ca2+ 内流或细胞内贮存Ca2+释放。对于这两种钙离子动员途径而言，细胞外Ca2+内流在结肠平滑肌收缩中起主要的作用［7］。细胞外钙离子内流主要通过三种钙通道：电压门控钙通道（voltage?dependent channel, VDC）、钙库调控性钙通道（store?operated channel, SOC）和受体操纵性钙通道（receptor?operated channel, ROC）。越来越多的证据表明，平滑肌细胞中的VDC、ROC和SOC相互协调参与促进胞外Ca2+内流［8］。胃肠道平滑肌的胞外钙离子主要通过VDC，尤其是L?型VDC进入细胞内［9，10］。细胞外高钾可以引起细胞膜的去极化，从而打开VDC，促使Ca2+内流，引起平滑肌收缩。本实验发现，痛泻要方可以抑制100 mmol/L KCl引起的肌条收缩，其作用机制可能是通过阻断VDC，抑制Ca2+内流。
SOC广泛分布于多种细胞，是内质网或肌浆网内钙库耗竭触发的外钙内流通道。研究表明，SOC的库容性钙离子内流（capacitative Ca2+ entry, CCE）是大鼠远端结肠平滑肌收缩激活信号钙离子重要来源之一［8］。另外，SOC具有在去极化时被抑制的特点［9］。因此在KCl和ACh引起外钙内流机制中可能不涉及SOC。
Thapsigargin是特异性钙池钙泵抑制剂，而对质膜上的钙泵无抑制作用［9］。Thapsigargin作为SOC的激动剂被广泛应用，它通过抑制Ca2+?ATP酶，阻断细胞内钙库对胞浆游离Ca2+的再摄取，使钙库内的Ca2+快速释放到胞浆。在细胞外无Ca2+时顺浓度梯度析出到胞外。EGTA是一种Ca2+螯合剂，可以将胞外的Ca2+螯合掉。因此二者合用可以耗竭细胞内的Ca2+，从而使SOC开放［9］。本实验中发现，痛泻要方可以浓度依赖地抑制内钙库耗竭后胞外Ca2+通过SOC内流引起的收缩，所以推测痛泻要方可能具有阻断SOC的作用。
痛泻要方抑制大鼠结肠平滑肌收缩的作用机制可能是通过阻断VDC、ROC和SOC，从而抑制胞外Ca2+内流，而不是通过抑制胞内Ca2+的释放。我们以前曾对谢建群教授腹泻型肠易激综合征的经验方——疏肝饮（痛泻要方加柴胡）作过类似研究，疏肝饮不仅可以抑制胞外Ca2+内流，还可以抑制胞内Ca2+的释放，而且抑制胞外Ca2+内流的起效浓度比痛泻要方低［15］。
【】
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