不同灌注方法对深低温停循环下脑保护的实验研究

              作者：宋兵，任旭东，张巧燕，李元敏，程殿威，祁泉，朱德明

【摘要】  目的 探讨不同灌注方法在深低温停循环下(DHCA)的脑保护的作用。方法 实验动物选用健康白乳猪幼猪(农科院提供)40只。随机分为4组，每组10只。A组：单纯DHCA组; B组：DHCA+逆行性脑灌注(RCP);C组：DHCA+单侧顺行性脑灌注( U-SACP);D组：DHCA+双侧顺行性脑灌注(B-SACP)。对照分析四组组间分别于CPB前(T1)、DHCA后30 min(T2)、60 min(T3)、90 min(T4)和复温再灌注30 min(T5)氧摄取率的变化。采用原位末端标记法(TUNEL染色法)观察和测定脑组织神经细胞凋亡的情况。结果 与A组相比，B组、C组和D组可显著减少幼猪DHCA后神经细胞凋亡数目(P<0.05),T2、T3和T4 3个时间窗脑氧摄取率明显低于A组，差异有显著意义(P<0.05)。A 组可见明显神经细胞凋亡改变，B组仅见中等程度神经细胞凋亡改变,C组和D两组见少量神经细胞凋亡改变,A组与B组,C组和D组、B组与C组和D组差异具统计学意义(P<0.05)，但是C组和D组差异没有统计学意义(P>0.05)。结论 SACP与RCP脑保护作用均优于DHCA，U-SACP与B-SACP脑保护作用好于RCP，但是两者差距没有统计学意义。

【关键词】  深低温停循环; 顺行性脑灌注; 逆行性脑灌注;体外循环

　　Abstract: OBJECTIVE To evaluate the protective effect of different perfusion during deep hypothermic circulatory arrest(DHCA). METHODS Fourty healthy baby pigs were randomly divided into four groups(10 pigs per group). Grouup A：simple DHCA, Group B：DHCA+retrograde cerebral perfusion (RCP), Group C：DHCA+unilateral selective antegrade cerebral perfusion(U-SACP), Group D：DHCA+bilateral selective antegrade cerebral perfusion(B-SACP). Measure oxygen enhancement ratio(OER) from blood which were taken in different window around DHCA. Neural apoptosis was identified by TUNEL in the brain. Comparely analysis the change of OER and the depression of neural apoptosis in the brain among four groups was performed. RESULTS OER levels were significantly difference at post DHCA 30 min(T2), 60min (T3), 90 min (T4) between group A and group B,C,D (P<0.05). The number of neural apoptosic cells in group B,C,D were decreased significantly during DHCA (P<0.05). The level of apoptosic cells in group B was much higher than that in group C and D(P<0.05),while that in group C was the same as the group D(P>0.05).CONCLUSION DHCA+RCP and DHCA+SACP are more both effective methods than DHCA on cerebral protection while the latter is more suitable. U-SACP and B-SACP are better than DHCA+RCP, but there was no difference between group C and D.

　　Key words： Deep hypothermic circulatory arrest;Selective antegrade cerebral perfusion; Retrograde cerebral perfusion;Cardiopulmonary bypass深低温停循环(deep hypothermic circulatory arrest,DHCA)是婴幼儿复杂先天性心脏病的重要技术，它可以保护大脑承受短时的缺血、缺氧，提供一个无血的手术环境。虽然手术与监护水平有了较大的提高，DHCA相关的脑损害仍时有发生[1]。 探讨不同灌注方法在DHCA时的脑保护的作用，成人病例在这方面做了大量工作，但是在儿童病例这种技术主要用于复杂先心病而非大动脉夹层等手术，因此，灌注方式又有所不同，本实验为后期研究提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与分组 实验动物选用白猪幼猪(农科院提供)40只，雌雄不限，体重7～9 kg。按随机数字表法分为4组，每组10只。A组：单纯行DHCA;B组：DHCA+ 逆行脑灌注(retrograde cerebral perfusion,RCP);C组：DHCA+单侧顺行性脑灌注(unilateral selective antegrade cerebral perfusion,U-SACP); D组：DHCA+双侧顺行性脑灌注(bilateral selective antegrade cerebral perfusion,B-SACP)。

　　1.2 麻醉与监护 乳猪于术前8 h禁食，肌肉注射阿托品0.02 mg/kg，氯胺酮20 mg/kg麻醉诱导，硫喷妥钠25 mg/kg耳缘静脉注射麻醉。气管内插管接呼吸机辅助呼吸，颈内静脉逆行穿刺并留置导管，用于抽取血液标本。

　　1.3 DHCA实验模型建立 胸骨正中切口，全身肝素化。升主动脉与上下腔静脉插管，建立体外循环(cardiopulmonary bypass,CPB)， CPB流量80 ml/(kg·min)，常温转流10 min后开始降温，控制降温时间20 min，降温至鼻咽温18℃左右时停循环。A 组停循环,B 组按维持颈静脉压25～30 mmHg 的灌注量经上腔静脉行RCP。C组：无名动脉与左颈总动脉之间阻断，并阻断右锁骨下动脉，按10 ml/(kg·min) 低流量行灌注。D组：在左颈总动脉与左锁骨下动脉之间阻断血管，并阻断右锁骨下动脉，灌注两侧颈总动脉，流量20 ml/(kg·min)。停循环90 min后开放主动脉并复温，复温时间大于30 min，鼻咽温36℃时脱离CPB。

　　1.4 标本采集与检测

　　1.4.1 血气分析和脑氧摄取率(oxygen enhancement ratio，OER) 各组分别于CPB降温前(T1)、停循环30 min(T2)、60 min(T3)、90 min(T4)、复温再灌注30 min(T5) 抽取颈静脉血1ml (RCP 时抽取主动脉返回血) 分别行血气分析检测, 测动脉与颈静脉血氧分压(PaO2，PjvO2) 、动脉与颈静脉血氧饱和度(SaO2，SjvO2) 及血红蛋白(Hb)的值。OER。OER=(CaO2-CjvO2)/CaO2×100%

　　CaO2=(Hb×1.36×SaO2)+(0.003×PaO2)

　　CjvO2=(Hb×1.36×SjvO2)+(0.003×PjvO2)

　　1.4.2 海马以及皮层神经细胞的凋亡检测 四组动物术后3天，在麻醉状态下，经一侧颈总动脉插管灌注37℃生理盐水，冲洗出血管内血液，直到静脉引流出的液体变清，4℃ 4%多聚甲醛行颈总动脉灌注，迅速开颅取脑，取中间块放入相同固定液中继续固定24 h。冠状切面切开猪脑，取出组织块行常规脱水、透明、石蜡包埋并切片，片厚4 μm，将石蜡切片常规脱蜡至水，用TUNEL法检测凋亡神经细胞。检测程序按试剂盒(由美国CHEMICON公司生物公司提供)操作说明进行。TUNEL图片结果采用Axioplan 2 imaging 医学显微图象分析系统进行图像分析。切片在光学显微镜高倍放大视野下随机选取脑皮层各10个视野，计数凋亡细胞数目和总细胞数，计算凋亡细胞指数(凋亡细胞指数=阳性细胞数/总细胞数×100%)。

　　1.5 统计方法 统计学处理采用SPSS 14.0 统计软件包，采用卡方检验，实验数据用均数±标准差(±s)表示，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 大脑皮层以及海马区域神经细胞凋亡的检测 TUNEL染色阳性细胞胞核中出现棕黄色颗粒。A组脑组织损伤明显，可见大量凋亡的棕黄色颗粒即凋亡的神经细胞(见图1)。 B组停循环同时逆行灌注后脑组织轻微损伤, 少量神经细胞变空, 多数为正常的神经细胞(见图2)。C组和D组停循环同时顺行灌注后脑组织基本正常, 神经细胞排列整齐，细胞密度大，核大而圆，核仁清晰，核膜光滑完整，细胞结构未见异常，大多数结构正常,少量空泡化(见图3和图4)。凋亡细胞计数及统计分析见表1，结果显示，与A组相比，B组、C组和D组神经细胞凋亡程度明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05)，B组与C组和D组比较差异具统计学意义(P<0.05)，但是C组和D组比较差异没有统计学意义(P>0.05)。

　　2.2 OER结果显示 B组与C组和D组在T3、T4和T5 3个时间窗OER明显低于A组，差异有显著著意义(P<0.05)，见表2。

　　3 讨 论

　　中枢神经系统的损伤是DHCA期间最严重的并发症，DHCA通过低温减少脑组织需氧量, 降低其代谢率，起到保护脑组织的作用，但是脑损害仍是制约DHCA主要因素[1]。DHCA后神经细胞发生凋亡、坏死导致神经元死亡，这个过程在停循环早期即开始，直至术后几天都存在，这是导致术后神经功表1 海马与皮层凋亡细胞的比较表2 OER结果能障碍的一个主要原因。

　　单纯DHCA安全时限有限, 不能保护大脑耐受较长时间的缺血、缺氧。在此期间结合脑灌注脑保护是延长安全时限的好方法, 尤以RCP与SACP应用较为广泛。SACP 顺行性灌注脑部，优点在于符合生理、灌注时限较长。Di Eusanio等[2]临床报告，DHCA+SACP技术是一种有效的DHCA脑保护方式。而且如果脑灌注时间超过90min并未增加病死率与神经功能障碍。Ueda等[3]指出SACP尽管使大部分患者中枢神经系统功能得到好的保护，使用当前选择性脑灌注技术，脑中风的发生率仍然十分高。SACP在理论上是最符合生理的。SACP时大脑持续的血流能提供DHCA时最佳的血流及代谢状态，维持脑部低温，提供代谢底物并带走代谢产物。上腔静脉RCP应用于DHCA脑保护已有30年，但是对此方法褒贬不一。Svensson等[4]指出神经认知方面DHCA+RCP与SACP没有差别，但是在大样本研究中DHCA+RCP可以带走脑组织的代谢产物,排除发生脑栓塞的可能性,从而减少脑中风。Appoo等[5]认为RCP是一种安全而且有效的方法。尽管RCP可以延长安全时间，但是多数研究认为RCP并不能给脑组织带来完全的灌注，由于上下腔静脉短路的存在，RCP无法对脑组织进行有效灌注，只有少量的血流由静脉系统回到动脉。Griepp[6]的研究未发现使用RCP对于临床上脑保护有多大帮助，相反，长时间的RCP，不仅增加暂时性神经系统障碍的发生率，还会增加手术后的中风发生率和病死率。上腔静脉灌注压较大时，发生脑水肿可能性增加，反而使得脑部并发症明显增加。RCP提供给脑的氧合血有限,这决定了它只能是DHCA下脑保护的辅助手段，实际上, DHCA后RCP超过一定时限(国内外报道不一)仍有不同程度的脑损害,但此时限对心脏手术者来说,意义是巨大的。

　　RCP及SACP先后被用于DHCA脑保护。对于两种灌注方法孰优孰劣尚有争议,越来越多的学者采用SACP 代替RCP用于脑保护。多项研究证明,DHCA中,ACP具有较好的脑保护作用, 优于RCP[7-8] 。

　　此前成人在这方面做了比较细致研究，儿童这种技术主要用于复杂先心病，因此，又有所不同。本实验结果显示,无论从OER还是凋亡检测分析结果不难看出, RCP及SACP在脑保护方面均优于单纯DHCA ，两种脑灌注方法均可为脑部提供氧源及能量物质,维持脑组织的能量代谢及神经细胞的能量储备并带走脑组织的代谢产物,有效保护脑组织，但是本实验显示SACP又优于RCP，U-SACP与B-SACP并没有显著性差别, 由于左、右颈内动脉和由锁骨下动脉根部发出的左、右椎动脉在脑底部形成Willis 环, 使得两侧颈内动脉和椎动脉相互沟通, 调节两侧脑半球的血液供应，因此，一侧血供中断可以通过另一侧补充，这也可能是U-SACP与B-SACP对脑保护无差别的原因。

　　因此，我们认为ACP对DHCA手术具有比较好的脑保护作用，值得推广。

【】
  　[1] Young WL,Lawton MT,Gupta DK,et al.Anesthetic management of deep hypothermic circulatory arrest for cerebral aneurysm clipping [J] . Anesthesiology, 2002, 96(2):497-503.

　　[2] Di Eusanio M,Schepens MA,Morshuis WJ,et al.Antegrade selective cerebral perfusion during operations on the thoracic aorta: Factors influencing survival and neurologic outcome in 413 patients[J].J Thorac Cardiovasc Surg,2002,124(6): 1080-1086.

　　[3] Ueda T,Shimizu H,Ito T,et al.Cerebral complications associated with selective perfusion of the arch vessels[J].Ann Thorac Surg,2000,70(5):1472-1477.

　　[4] Svensson LG,Nadolny EM,Penney DL,et al.Prospective randomized neurocognitive and S-100 study of hypothermic circulatory arrest, retrograde brain perfusion, and antegrade brain perfusion for aortic arch operations[J].Ann Thorac Surg,2001,71(6):1905-1912.

　　[5] Appoo JJ,Augoustides JG,Pochettino A,et al.Perioperative outcome in adults undergoing elective deep hypothermic circulatory arrest with retrograde cerebral perfusion in proximal aortic arch repair: evaluation of protocol-based care[J].J Cardiothorac Vasc Anesth, 2006,20(1):3-7.

　　[6] Griepp RB.Cerebral protection during aortic arch surgery[J].J Thorac Cardiovasc Surg, 2001,121(3):425-427.

　　[7] Immer FF, Lippeck C, Barmettler H,et al. Improvement of quality of life after surgery on the thoracic aorta: effect of antegrade cerebral perfusion and short duration of deep hypothermic circulatory arrest[J]. Circulation，2004，110(11 Suppl 1):II250-255.

　　[8] 徐志云,王为,黄盛东,等. 深低温停循环经右锁骨下动脉持续脑灌注与经上腔静脉逆行脑灌注的比较[J]. 中华实验外科杂志, 2005, 22 (5) : 574 - 576.