转化生长因子-β1在体外循环后肺组织表达及N-乙酰半胱氨酸干预
【摘要】 目的 观察转化生长因子-β1(TGF-β1)在犬体外循环(CPB)后肺组织的表达及N-乙酰半胱氨酸(NAC)对其表达的影响。方法 建立成年犬CPB相关肺损伤模型，随机分为三组，每组8例。C组(CPB中用生理盐水)，N1组(CPB前用NAC)，N2组(CPB中用NAC)。通过监测5个不同时段，即CPB)前(T0)、CPB中30 min(T1)、停机后15 min(T2)、30 min(T3)和60 min(T4)时间点取肺组织标本，检测肺组织TGF-β1的表达及髓过氧化物酶(MPO)活性，同时于T0、T3、T4时间点抽取动脉血测定呼吸指数(RI)。结果 T0时三组RI差异无统计学意义(P>0.05)，与C组比较，N1组、N2组T3、T4时的RI升高幅度低(P<0.05)，且N1组低于N2组(P<0.05);T0时三组肺组织中MPO活性差异无统计学意义(P>0.05)， 在T2、T3、T4时，N1组、N2组肺组织中MPO活性低于C组(P<0.05);T0时三组肺组织中偶见TGF-β1表达，随CPB时间的延长，TGF-β1表达均增强，且N1组弱于N2组、C组(P<0.05)。结论 CPB可使肺组织TGF-β1表达明显增强，NAC能抑制肺组织TGF-β1的表达，改善RI，减轻肺损伤;且保护效果CPB前NAC的优于CPB中用NAC。
【关键词】 转化生长因子-β1;N-乙酰半胱氨酸;体外循环;肺;损伤;犬
Abstract: OBJECTIVE To observe in expression of TGF-β1 in lung tissues of acute lung injury dog model induced by cardiopulmonary bypass (CPB) and the effect of N-acetylcysteine (NAC) on it's expression. METHODS Twenty-four adult health dogs, were randomly divided into three groups:groupC(received normal saline after CPB), groupN1 (receive NAC given intravenously before CPB started), group N2 (receive NAC aftere CPB started). Lung tissue samples were collected before CPB(T0), at 30min after start of CPB(T1), 15min (T2), 30 min (T3), 60 min (T4) after end of CPB in all groups. The expression of TGF-β1, myeloperoxidase (MPO) of lung tissue was detected at above mentioned time points. Histology of lung under microscope in 3 groups were examined. Blood samples were collected from femoral artery for monitoring respiratory index(RI)at T0,T2, T3. RESULTS No significant differences were found in the levels of RI in all three groups atT0. However, at T3,T4, the RI significantly higher in group c than in group N1, N2(P<0.05) and significantly lower in group N1 than in group N2(P<0.05); No significant differences were found in the level of MPO activity in the three groups at T0. MPO activity were significantly lower in group N1, N2 than those in group C at T2, T3,T4(P<0.05); The expression of TGF-β1 was occasionally detected at T0(P>0.05), they were significantly lower in group N1, N2 than those in group C (P<0.01), and significantly lower in group N1 than in group N2 (P<0.05). CONCLUSION The expression of TGF-β1 significantly increased after CPB. NAC could suppress expression of TGF-β1, improve RI，may provide better protection against the injuries. The protective effect is better in group N2 than in group N1.
Key words： TGF-β1;N-acetylcysteine;Cardiopulmonary bypass;Lung;Injury;Dog
体外循环(cardiopulmonary bypass, CPB)是一个非生理性过程，可诱发一系列的急性炎性反应，CPB可导致肺功能的亚临床性损伤，主要表现为肺水肿引起的低氧血症[1]。转化生长因子-β1(TGF-β1)作为重要的生长调节因子， 在组织的损伤与修复过程中扮演重要角色。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)是左旋精氨酸的天然衍生物，分子内含有活性的-SH基团，具有抗氧化性，能灭活活性氧化代谢物(ROS)，稳定细胞膜及胞内膜的结构，稳定胞内酶类及蛋白质的功能，可减轻急性肺损伤[2-5]。但其能否通过影响肺组织TGF-β1表达从而减轻肺损伤鲜见报道。本研究拟通过建立犬CPB模型，测定CPB后肺组织中TGF-β1表达水平，探讨NAC对CPB后肺组织TGF-β1表达的影响，为揭示急性肺损伤的发病机制提供理论依据并为临床防治提供新思路。
1 资料与方法
1.1 材料 成年犬 (由南方医科大学动物中心提供) 24只，体重(15.0±1.0)kg。雌雄不拘。随机分为三组，每组8例。N1组在CPB开始前静脉注射NAC( Sigma公司，美国) 150 mg/kg，余50 mg/kg 静脉维持泵入至实验结束;N2组在CPB开始后复温前静脉注入NAC用法、用量同N1组;C组在CPB开始后复温前静脉注入等容量的生理盐水。参照Williams等[6]建立成年犬的CPB模型：动物实验前8 h禁食，4 h禁水。腹腔内注射2.5%戊巴比妥25 mg/kg，麻醉后气管插管，用呼吸机辅助呼吸，FiO2100%，潮气量8～10 ml/kg。股动静脉插管测压，胸骨正中开胸，3 mg/kg肝素化后，分别于锁骨下动脉插管16F，右心房插入32F腔静脉引流管，并在左心房放置引流管，连接人工心肺机(Sarns-7000血泵，3M公司，美国)，建立CPB，常规流量125 ml/(kg·min)，并行循环5 min开始降温至鼻温25℃，流量调至35 ml/(kg·min)，MAP维持在35～45 mmHg，维持 60 min后复温，流量恢复至125 ml/(kg·min)，再继续维持60 min，至鼻温37℃后停机，总转流时间为120 min。
1.2 检测指标与方法
1.2.1 标本采集 连续监测心电图、MAP、CVP。分别于CPB前(T0)、CPB流转30 min(T1)、CPB停机后 15 min(T2)、 30 min(T3)、60 min(T4)5个时间点采集标本。在T0、T3和T4时点取股动脉血用GEM premierTM3000 血气分析仪(Instrumentation Laboratory公司，美国)直接测呼吸指数(respiratory index,RI)。分别于各时点取左上肺组织约3.0 g。每组各取3只动物肺组织,经相关处理后行透射电镜观察。
1.2.2 肺组织学检查 肺组织中髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性测定采用专用MPO试剂盒，先准确称取肺组织重量，按重量体积比用匀浆缓冲液(试剂盒中自备)进行匀浆，其后所有步骤均严格按照试剂盒说明书要求进行，最后用UV-2000型分光光度计测量特定波长下A值。MPO活性单位定义为：每克肺组织湿片在37℃反应体系中过氧化氢(H2O2)被分解1μmol为一个酶活性单位。
1.2.3 肺组织TGF-β1表达 采用二步法免疫组化染色测肺组织中TGF-β1表达，同时利用Leica DM 1000显微镜摄片，应用Miaspro.V4.0图像分析系统(四川大学机图像图形研究所)中的免疫组化模块进行TGF-β1表达的定量分析：每组取6张切片，每张切片随机选取5个不重复视野，分别求出每个视野内单位面积的平均灰度值，其平均灰度值与该肺组织TGF-β1的表达水平成反比。
1.3 统计学分析 用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料均以均数±标准差(±s)表示，组内、组间比较采用单因数方差分析或多元方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 RI变化 T0时各组RI差异无统计学意义(P>0.05);在T3、T4时，三组动物的RI与T0时相比均有显著升高(P<0.01)。组间比较，C组高于N1组、N2组 (P<0.05)，且N1组低于N2组(P<0.05)。见表1。表1 三组动物呼吸指数(RI)的变化 注：与T0比较*P<0.05;与C 组比较#P<0.01;
与N1组比较，▲P<0.05
2.2 肺组织中MPO活性变化 在T0时各组比较差异无统计学意义(P>0.05);各组T1～T4与T0比较MPO活性均有增加(P<0.05)。与C组比较， N1组、N2组各时间点MPO活性均有降低(P<0.01);与N1组比较， N2组各时间点差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
2.3 肺组织TGF-β1表达 肺组织TGF-β1表达水平见表3。各组间T0时比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图1～2(400×)。各组T1～T4与T0比较，TGF-β1表达均增强(P<0.05)。与N1组比较，N2组、C组各时间点肺组织TGF-β1表达均增强(P<0.05);与N2组比较，C组除T1外其余时间点TGF-β1表达均增强(P<0.05)。N2组T1时点与C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。图像分析结果显示，平均灰度值N1组高于相同时间点N2组、C组(P<0.05)，肺泡上皮细胞、肺泡壁TGF-β1阳性表达较C组明显减弱;N2组高于相同时间点C组(P<0.05),肺泡上皮细胞、肺泡壁阳性表达也较C组明显减弱，但较N1组明显增强,见图3～6(400×)。
3 讨 论
CPB是心内直视手术的一项重要技术，CPB过程中，血液成分与人工材料大面积接触，激活了炎性细胞与多种体液因子，引起各种炎性介质、趋化因子、蛋白酶的系列释放与ROS的生成，造成肺不同程度的损伤。如何有效地进行肺保护是麻醉与心血管的一项重要课题。本实验在C组CPB中单次静脉滴注生理盐水;停CPB后发现犬很快出现呼吸急促，RI进行性上升， 光学显微镜检查提示肺部急性损伤的存在。MPO与CPB前相比显著升高，反应肺组织白细胞的活化程度高。本研究中，N1、N2组的图1 C组T0时未见阳性表达 图2 N1组T0时偶见阳性表达 图3 C组T2时阳性表达增强表2 三组不同时间点肺组织MPO活性的比较表3 肺组织TGF-β1平均灰度值的变化注：与T0比较*P<0.05 ,与N1组比较#P<0.05 ,与C组比较▲P<0.05
RI、MPO较C组明显低，且N1组的RI明显低于N2组，说明在CPB前或后应用NAC均可减轻CPB相关肺损伤，且在CPB前用更有效。
TGF-β1是一种多效能的生长因子,广泛地存在于多种动物组织和细胞内，肺脏是富含TGF-β1的器官之一[7]，广泛地参与各种病理生理过程。TGF-β1可增强对组织损伤的效应，它能减少血管内皮细胞谷胱甘肽含量而增加其渗透性[8], 导致大量的红细胞和炎性细胞进入肺泡腔,释放大量炎性介质,导致肺损伤。TGF-β1 还具有炎性细胞趋化性，它可引起肺内炎细胞的聚集,特别是多形核中性粒细胞(PMN)在肺内的聚集，呼吸爆发产生ROS聚集，又引起TGF-β1的释放,形成放大反应, 导致肺损伤[9]。本研究结果显示CPB后同一时间点N1、N2组(除T1外)TGF-β1的表达弱于C组，特别是在T3时，C组TGF-β1的表达非常强烈，而且光镜下可见CPB后， N1、N2组肺组织损伤均较C组明显减轻，表明NAC可能通过降低CPB过程中肺组织TGF-β1的表达，减弱TGF-β1的炎细胞趋化作用，从而减轻肺损伤，达到肺保护作用。T1时N2组TGF-β1的表达与C组相近，而N1组TGF-β1的表达弱于N2组、C组，这说明早期应用NAC，能早期有效地减低TGF-β1的表达，可能达到更好的保护作用。
由于CPB后诱导TGF-β1表达机制涉及到多种因素、多个环节。因此，NAC下调CPB后肺组织TGF-β1表达机制也可能涉及多个方面。其机制可能以下几个方面：①NAC的抗炎作用：通过抑制肺组织NF-кβ表达、下调促炎性细胞因子(如TNF-α、IL-lβ等)高表达，减少PMN趋化的作用[10-11]。②NAC的抗氧化作用：NAC是一种含有半胱氨酸结构的化合物，它的巯基可作为H+ 供体而发挥直接的抗氧化作用， NAC进入体内后迅速脱去乙酰基变为半胱氨酸，半胱氨酸是还原型谷胱甘肽(GSH)的前体，而GSH是细胞内重要的非酶类抗氧化物，能灭活ROS。 Eren[12]等研究证实在CPB相关动物肺损伤模型中NAC能降低肺组织中的MPO含量。③NAC对蛋白酶抑制剂的保护作用：NAC能提高多种细胞内的GSH储量，保护细胞内弹性蛋白酶抑制剂不被ROS灭活[13]。从而使蛋白酶/抗蛋白酶系统趋于平衡，保护肺组织免受蛋白酶的破坏。
综上所述， CPB可使肺组织TGF-β1表达明显增强，NAC能抑制肺组织TGF-β1的表达、改善RI从而减轻肺损伤;且CPB前NAC的保护效果且优于CPB中用NAC。
【】
[1] 徐康清, 陈秉学, 黄文起, 等. 体外循环心脏手术围术期肺的炎性反应 [J]. 中华麻醉学杂志, 2002, 22(12): 724-727.
[2] Ritter C, da Cunha AA, Echer IC, et al. Effects of N-acetylcysteine plus deferox- amine in lipopolysaccharide-induced acute lung injury in the rat [J]. Crit Care Med，2006, 34(2): 471-477.
[3] 吴河冰, 金鑫，田元，等. N-乙酰半胱氨酸对小鼠肝部分缺血/再灌注后肝肺损伤的保护作用 [J]. 危重病急救医学, 2007, 19(7): 394-397.
[4] Akca T, Canbaz H, Tataroglu C,et al.The effect of N-acetylcysteine on pulmonary lipid peroxidation and tissue damage [J]. J Surg Res，2005,129(1):38-45.
[5] Kao SJ, Wang D, Lin HI,et al. N-acetylcycsteine abrogates acute lung injury induced by endotoxin [J]. Clin Exp Pharmacol Physiol,2006, 33 (1-2):33-40.
[6] Williams EA, Welty SE, Geske RS, et al.Liquid lung ventilation reduces neutrophil sequestration in a neonatal swine model of cardiopulmonary bypass [J]. Crit Care Med, 2001, 29(4): 789-795.
[7] Yu L, Border WA, Huang Y,et al. TGF-beta isoforms in renal fibrogenesis.[J]. Kidney Int, 2003, 64(3):844-856.
[8] Pittet J F , Griffiths MJ , Geiser T ,et al. TGF2beta is a critical mediator of acute lung injury [J]. J Clin Invest ,2001 ,107(12):1537-1544.
[9] de Boer WI , van Schadewijk A , Sont JK, et al . Transforming growth factor beta l and recruitment of macrophages and mast cells in airways in chronicobstructive pulmonary disease [J]. AmJ Respir Crit Care Med , 1998 , 158(6):1951-1957.
[10] Jafari B, Ouyang B, Li LF,et al. Intracellular glutathione in stretch-induced cytokine release from alveolar type-2 like cells [J]. Respirology, 2004, 9(1):43-53.
[11] Hagiwara SI, Ishi Y, Kitamura S. Aerosolized administration of N-acetylcysteine attenuates lung fibrosis induced by bleomycin in mice [J]. Am J Respir Crit Care Med, 2000, 162(1): 225-231.
[12] Cakir O, Oruc A, Kaya S, et al. N-acetylcysteine Reduces Lung Reperfusion Injury After Deep Hypothermia and Total Circulatory Arrest [J]. J Card Surg, 2004, 19(3): 221-225.
[13] Barrios R, Shi ZZ, Kala SV, et al. Oxygen induced pulmonary injury in gamma glulamyl transpeptidas-deficienl mice [J]. Lung, 2001, 179(5): 319-330.
