缺血预适应通过抑制Smad 3蛋白表达减少心肌细胞凋亡的实验研究

                作者：肖健，王志农，朱镇，黄盛东，徐志云，张宝仁

【摘要】  目的 探讨Smad 3蛋白(small mother against decapentaplegic)在心肌细胞缺血再灌注损伤中与心肌细胞凋亡之间的关系。方法 新生SD大鼠心肌细胞随机分为3组：① 正常对照组（A组）：在不含处理因素的含10％胎牛血清DMEM培养基在有氧培养箱（37℃、5% CO2和95%空气）中培养48 h; ② 缺血再灌注(IR)诱导凋亡模型组（B组）：不含血清的低糖DMEM培养基在缺氧培养箱（95%N2和5%CO2）中培养48 h后，再用10％胎牛血清DMEM培养基在有氧培养箱中培养3 h； ③ 缺血预适应（IPC）组（C组）：不含血清的低糖DMEM培养基在缺氧培养箱中培养6 h后，再用10％胎牛血清DMEM培养基在有氧培养箱中培养3 h,再进行缺血再灌注（步骤同B组）。结果 A组、B组和C组心肌细胞凋亡率分别为（5.89±1.28）％、（26.68±6.17）%、（12.45±1.52）%，具有显著统计学差异。三组细胞Smad 3表达量分别为（21.77±2.32）％、（35.7±2.43）%、（29.47±1.36）%，具有显著统计学差异。结论 Smad 3可以诱导心肌细胞缺血再灌注损伤后心肌细胞凋亡，而缺血预适应可抑制Smad 3的表达，从而保护心肌细胞。

【关键词】  缺血再灌注；缺血预适应；Smad 3；心肌细胞；凋亡

    Abstract: OBJECTIVE   To research the relationship of Smad 3 and myocardiocyte apoptosis stimulated by  ischemia reperfusion injury(IR).METHODS  The myocardiocytes of neonatal SD rats were divided randomly into 3 group. In group A (control group), the cells were cultured with modified DMEM with 10％ FBS in a modified chamber and mixture gas(95％air and 5％CO2) for 48 hr；In group B (ischemia-reperfusion injury group), the cells were cultured with low carbohydrates DMEM under the condition of hypoxia (95% N2 and 5% CO2; the O2 partial pressure was lower than 5 mmHg) for 48 hr, and then cultured with modified DMEM with 10％ FBS in a modified chamber and mixture gas for 3 hr; In group C (ischemic preconditioning group), after cultured with low carbohydrates DMEM under the condition of hypoxia for 6 hr, the cells were cultured with modified DMEM with 10% FBS in a modified chamber and mixture gas for 3 hr, and then culture with the identical condition as group B. RESULTS  There was significant deference in myocardiocyte apoptosis among group A (5.89±1.28)%, B (26.28±6.17)% and C (12.45±1.52)% (P＜0.05). There was also significant deference in the quantity of Smad 3 among group A (21.77±2.32)％, B (35.7±2.43)% and C (29.47±1.36)%( P＜0.05).CONCLUSION  Apoptosis stimulated by ischemia－reperfusion injury may be mediated by Smad 3, and the Smad 3 may be inhibited by ischemic preconditioning.

    Key words：  Ischemia－reperfusion injury;Ischemic preconditioning；Smad 3;Apoptosis;Myocardiocyte

    心脏外科手术后心肌细胞缺血再灌注损伤（Ischemia－reperfusion injury，IRI）是心肌细胞凋亡心肌损害的主要原因。以往研究证实在心肌细胞IRI中，多种细胞因子参与损伤过程中的信号转导。研究较多的是肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1（IL-1）等细胞因子，近年来研究证实Smad 3信号转导系统在心肌IRI中发挥着重要作用。本实验采用体外缺氧培养模拟心肌细胞IRI，采用ELISA法定量分析缺血预适应后(ischemic pre-conditioning，IPC)心肌细胞Smad 3表达量的变化，并进一步探讨在心肌细胞IPC抑制心肌细胞凋亡的可能机制。

    1  材料与方法

    1.1  主要仪器与试剂  三气（缺氧）培养箱（公司，日本），流式细胞仪（FACS calibur型，Becton-Dickinson公司，美国），Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞分析试剂盒（Pharmigen公司，美国），Smad 3蛋白检测试剂盒（ADL公司）。

    1.2  乳鼠心肌细胞培养  实验动物为健康Sprague-Dawley乳鼠，出生1～3 d，雌雄不拘，由第二军医大学实验动物中心提供。按改良的Simpson等的方法进行消化分离［1］心肌细胞。SD大鼠常规皮肤消毒后开胸取心脏，放入冷DMEM培养基（pH 7.0～7.2）中洗去残血，取心尖部，剪成约1 mm3 小块，加适量0.125％胰蛋白酶（pH 7.0～7.2）于37℃水浴搅拌（＜800 r/min）分次消化，每次15 min。收集除第1 次以外的细胞悬液，加等量含10％小牛血清的DMEM培养基终止消化，离心（1 000 r/min，3 min），弃上清，沉淀以10％小牛血清的DMEM培养基重悬，经200目不锈钢网过滤。细胞悬液装入100 ml 培养瓶中，CO2培养箱37℃培养90 min，差速贴壁法去除非心肌细胞。吸出未贴壁的细胞悬液，以1×105/cm2的细胞密度接种于6孔板。

    1.3  缺血再灌注及缺血预适应模型制作及分组  缺血再灌注及缺血预适应模型的制作及分组：心肌细胞培养4 d后开始实验。A组为正常对照组，即在不含处理因素的含10％胎牛血清DMEM培养基和有氧培养箱（37℃、5%CO2、95%Air）中培养48 h；B组即缺血再灌注组，以低糖DMEM培养基，在缺氧培养箱 (95N2 %、5%CO2 )中培养，模拟心肌细胞缺血缺氧48 h后，再用10％胎牛血清DMEM培养基和有氧培养箱中培养3 h，模拟缺血再灌注损伤；C组即在模拟缺血再灌注损伤之前，以不含血清的低糖DMEM培养基和缺氧培养箱（95%N2,5%CO2）中培养6 h后，再在10％胎牛血清DMEM培养基和有氧培养箱中培养3 h；模拟缺血预适应，余同B组。

    1.4  观测指标及方法 

    1.4.1  流式细胞术检测各组心肌细胞凋亡指数  0.125胰酶（37℃，15 min）消化贴壁的心肌细胞,PBS洗涤2次，离心收集细胞，500 ul buffer缓冲液悬浮细胞，加入Annexin V/PI（各5 ul）双染细胞，避光反应15 min。流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488 nm。 

    1.4.2  Smad 3检测  收集细胞上清液，机械法收集细胞加入已收集的细胞上清液，超声裂解细胞，待检测。取出酶标板，依照次序对应分别加入50 μl的标准品于空白微孔中;分别标记样品编号，加入50 μl样品于空白微孔中；在样品孔中加入10 μl的生物素标记液；在标准品孔和样品孔中加入100 μl的酶标记溶液；(36±2)℃孵育反应 60  min;洗板机清洗5次，每次静置10～20 s；每孔加入底物A、B液各50 μl； (36±2) ℃下避光孵育反应15 min；每孔加入50 μl终止液，终止反应；于波长450 nm的酶标仪上读取各孔的OD值；以OD值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制曲线图；根据样品的OD值查找对应的浓度范围。

    1.5  统计学分析  应用SPSS 11.0统计软件对资料进行统计分析，数据均以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素ANOVA分析， 比较统计量F值，Smad 3与细胞凋亡比率之间进行相关分析，P＜0.05为有显著性差异。

    2  结  果

    2.1  培养心肌细胞情况  采用上述分离纯化方法培养的绝大多数为心肌细胞，贴壁生长后由圆形变为多角形，成簇生长，呈现不同频率自发搏动。

    2.2  模拟心肌细胞IRI  细胞IRI后心肌细胞Smad 3明显增高，IPC后细胞凋亡率明显减少。

    2.3  各组心肌细胞IRI后心肌细胞凋亡比率及Smad 3表达比较  各组凋亡率和Smad 3表达量进行方差分析，P＜0.05，说明各组间凋亡率和Smad 3表达量存在显著差异；凋亡率和Smad 3表达量进行相关分析，r＝0.947，P＜0.05，见图1、图2、图3。

    3  讨  论

    细胞凋亡是近年来分子生物学领域研究的热点之一，心肌IRI中心肌细胞凋亡和坏死是两种不同的细胞死亡机制。有研究发现，心肌缺血后再灌注时核内DNA片段明显高于单纯心肌缺血而无再灌注者，说明缺血再灌注可能触发或加速了心肌细胞凋亡。而且细胞凋亡是一个耗能过程，常常会由于心肌持续性缺血、缺氧，能量消耗而不能正常进行，早期再灌注恢复了能量供应，可以为凋亡程序的完成提供能量，促进凋亡进程［2］。IPC可同时减少心肌细胞的坏死和凋亡，这一作用体现了IPC在心肌保护方面独特的优势。同时也提示IPC是通过一种与以往心肌保护方法所不同的机制实现其对心肌的保护作用［3］。以往对IPC机制的研究主要集中在偶联蛋白激酶C（PKC）、线粒体钾通道、钙通道等。

    Smad蛋白家族是属于转换生长因子（TGF）超家族的下游信号转导分子，是目前发现的TGF唯一的作用底物，是把TGF信号从细胞外传递到细胞核的中介分子，在TGF信号传递过程中起着重要的作用［4］。TGF超家族包括TGF-β家族和BMP家族，二者是Smad蛋白的经典的激活因子。TGF-β家族与BMP家族对心肌细胞的作用截然不同。在成熟心肌细胞中TGF-β的主要作用是有害的，它不仅可以通过Smad 3蛋白诱导心肌的纤维化，更加重要的是还可以诱导心肌细胞的凋亡［5］。同时TGF-β/Smad 3通路还可以激活某些诱导细胞凋亡的蛋白激酶（如 death-associating protein，DAP）［6］；相反，BMP家族通过Smad1对心肌细胞具有保护的作用。例如：BMP2和Smad1可以通过调节bcl-xL基因的表达减少心肌细胞缺血再灌注损伤引起的线粒体的损伤、Bax染色体易位、细胞色素C释放到细胞液和细胞的凋亡［7］。有研究表明，心肌梗死后TGF-β升高，同时Smad 2、3、4也被激活，这些因子的表达导致了心力衰竭的进一步加重［8］。

    本实验采用体外模拟心肌细胞IRI及IPC的方法，探讨Smad 3对IRI致心肌细胞凋亡的影响及其与IPC的关系。Yang BC的研究结果认为，缺血培养时间24 h，复氧培养3 h，凋亡为最高峰，以后随着复氧培养时间的延长，凋亡不再增加［9］。本研究结果显示IRI后心肌细胞Smad 3明显增高，而IPC后心肌细胞凋亡率和Smad 3较缺血再灌注组明显减少，与其结果一致。另外有研究显示IRI后心肌细胞膜的改变是细胞凋亡的重要病理特征［10］，我们推测IPC对Smad 3激活和表达的抑制可能是通过细胞膜蛋白构象的改变来实现的，但尚需进一步证实。

    综上所述，Smad 3参与心肌细胞IRI后细胞凋亡的信号传导，而IPC可抑制Smad 3的表达，从而进一步保护心肌，这可能对心脏外科手术中防止或减轻心肌细胞损害、保护心功能具有重要意义，同时也能为IPC机制的研究提供一个新的思路。

【】
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［6］ Jang CW, Chen CH, Chen CC, et al. TGF-beta induces apoptosis through Smad-mediated expression of DAP-kinase ［J］. Nat Cell Biol,2002,4(1): 51-58.

［7］ Masaki M，Izumi M, Oshima Y,et al. Smad1 protects cardiomyocytes from ischemia-reperfusion injury ［J］. Circulation，2005，111(21): 2752-2759.

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［9］ Yang BC, Zander DS， Mehta JL. Hypoxia-reoxygenation-induced apoptosis in cultured adult rat myocytes and the protective effect of platelets and transforming growth factor-beta(1) ［J］.J Pharmacol Exp Ther,1999，291（2）： 733-738.

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