吡咯烷二硫氨基甲酸酯对犬心肌线粒体损伤的保护作用

                               作者：孟素峰，李有清，王启明 

【摘要】  目的 观察吡咯烷二硫氨基甲酸酯(PDTC)对体外循环(extracorporeal circulation,ECC)中犬心肌线粒体损伤的保护作用。方法 12只犬随机分为对照组(C组,n=6)和PDTC组(P组,n=6)，腹腔内注射戊巴比妥钠25 mg/kg麻醉后建立ECC心肌缺血再灌注模型。P组于ECC前静脉注射PDTC 20 mg/kg，C组静脉注射等量生理盐水。分别于ECC前、阻断主动脉60 min、开放主动脉30 min和60 min时，测定心肌线粒体超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX）、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)和线粒体肿胀度(MSD)。结果 与ECC前比较，两组阻断主动脉后SOD、GSH-PX及T-AOC均降低(P＜0.01)，MDA和MSD含量均升高；开放主动脉后C组SOD、GSH-PX及T-AOC均降低(P＜0.01)，MSD和MDA含量均升高(P＜0.01)；P组在开放主动脉60 min时SOD、GSH-PX、T-AOC、MSD和MDA含量差异无统计学意义(P＞0.05)。P组在阻断主动脉60 min时和开放主动脉后SOD、GSH-PX及T-AOC均显著高于C组(P＜0.01)，MSD和MDA含量均显著低于C组(P＜0.01)。结论 ECC中使用PDTC可提高心肌线粒体抗氧化能力，减轻心肌线粒体损伤。

【关键词】  吡咯烷二硫氨基甲酸酯；线粒体；体外循环；心肌保护

    Abstract: OBJECTIVE   To observe the effect of pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC)on canine myocardial mitochondrial injury during extracorporeal circulation (ECC). METHODS  Twelve healthy mongrel dogs undergoing ECC were randomly allocated into control group(group C,n=6)and PDTC pretreatment group(group P,n=6).All  dogs were anesthesitized with 2.5% sodium pentobarbitone 25 mg/kg.After tracheal intubation,the myocardial ischemia-reperfusion injury model during ECC was made by declamping(DC)after  aortic cross-clamping(AC)for 60 min.In group P,PDTC 20 mg/kg was administered intravenously before ECC，while in group C physiological saline was given instead of PDTC.Myocardial mitochondria were isolated before ECC,60 min after AC，30 min and 60 min after DC for determination of superoxide dismutase (SOD),glutathione peroxidase(GSH-PX),malondialdehyde(MDA),total anti-oxidation capacity (T-AOC) and mitochondrial swelling degree(MSD). RESULTS  The myocardial mitochondria of SOD,GSH-PX and T-AOC were decreased，while MDA and MSD were increased after AC as compared to the value before ECC in both groups(P＜0.01).SOD,GSH-PX and T-AOC were decreased，while MDA and MSD were increased after DC as compared to the value before ECC in group C(P＜0.01).The myocardial mitochondria of group P at 60 min after DC had not significant differences in content of MDA,SOD,GSH-PX,T-AOC and MSD(P＞0.05).SOD,GSH-PX and T-AOC were distinctly lower，while MDA and MSD were distinctly higher at 60 min after AC and after DC in group P than those in group C(P＜0.01). CONCLUSION  Pretreatment with PDTC is effective in improving the anti-oxidation ability of myocardial mitochondria and attenuate myocardial mitochondrial injury.

    Key words：  Pyrrolidine dithiocarbamate;Mitochondria;Extracorporeal circulation；Myocardial protection

    线粒体是心肌细胞进行生物氧化和能量转换的主要场所,线粒体损伤和功能障碍与心肌缺血再灌注损伤的发生有密切关系［1-2］。但迄今为止，有关ECC中脂质过氧化反应对心肌细胞线粒体结构和抗氧化能力影响的报道甚少。抗氧化剂吡咯烷二硫氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)是一种新型抗氧化剂，具有抑制炎性反应、减少氧自由基的产生和稳定细胞膜的作用。本研究旨在探讨PDTC对ECC犬心肌细胞线粒体结构和抗氧化能力的影响，为PDTC在心肌缺血再灌注损伤中的研究提供依据。

    1  资料与方法

    1.1  主要试剂  PDTC（美国Sigma公司），超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

    1.2  动物分组及模型的建立  健康成年杂种犬12条(天津医科大学实验动物中心供)，手术当日晨禁食，体重12～18 kg，雌雄不拘，随机分为对照组(C组）和PDTC组(P组)，每组6只。麻醉后行气管内插管,连接呼吸机行机械通气，潮气量12 ml/kg，呼吸频率16 次/min。股动、静脉置管监测平均动脉压(MAP)和中心静脉压(CVP)。取胸骨正中切口,切开心包，右心房内注射肝素3 mg/kg,左锁骨下动脉和右心房分别插管,连接人工心肺机、氧合器及动、静脉管道。升主动脉根部安置一次性使用心脏停搏液灌注器。开始ECC前5 min，调节循环水温度至28℃～30℃，P组与C组分别经股静脉注射PDTC 20 mg/kg及等量生理盐水。稳定并行循环5 min后阻断升主动脉，主动脉根部灌入4℃St.Thomas停搏液(10 ml/kg)，转机流量为60～80 ml/(min·kg)，阻断升主动脉60 min。开放升主动脉后观察循环情况60 min。

    1.3  指标测定  采用差速离心法提取心肌线粒体［3］。分别于ECC前、阻断60 min、开放60 min时取左心室前壁心肌，称重后,按1∶9(w/v)比例加入分离液(包括0.225 mol/L D-mannitol,0.075 mol/L sucrose,0.05 mol/L EDTA,10 mol/L Tris-HCI，pH 7.4), 置于0℃～4℃冰浴中的烧杯内,快速剪碎,以超声匀浆器匀浆，600×g 4℃低温离心5 min，取上清液,分离液悬浮沉淀，再次超声匀浆,重复2次。4次离心所得到的上清液再以10 000×g 4℃低温离心10 min,沉淀即为线粒体。用分离液重悬后，以牛血清白蛋白(BSA)为标准品，考马斯亮蓝法测定线粒体悬液蛋白浓度，分别取100 g/L的线粒体0.2 ml测定MDA和GSH-PX，分别取10 g/L的线粒体50 μL测定SOD和T-AOC。参照［3］测定线粒体悬液520 nm处吸光度值，作为线粒体肿胀的指标。

    1.4  统计学方法   数据资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

   2  结  果

    2.1  心肌线粒体SOD、GSH-PX和T-AOC的变化  与ECC前比较，阻断主动脉60 min、开放主动脉30 min和60 min时C组SOD、GSH-PX和T-AOC均降低(P＜0.01)；阻断60 min主动脉和开放主动脉30 min时P组SOD、GSH-PX和T-AOC均降低(P＜0.05)；开放主动脉60 min时P组SOD、GSH-PX和T-AOC均恢复至CPB前水平(P＞0.05)。阻断主动脉60 min、开放主动脉30 min和60 min时P组SOD、GSH-PX和T-AOC均高于C组(P＜0.01)。见表1。

    2.2  心肌细胞线粒体MDA和MSD的变化  线粒体肿胀导致其浊度降低,表现为520 nm处吸光值的下降，吸光度降低与线粒体的肿胀程度呈正比。与ECC前比较，阻断主动脉60 min、开放主动脉30 min和60  min时C组MDA和MSD均增加 (P＜0.01)，阻断主动脉60 min和开放主动脉30 min时P组MDA和MSD均增加(P＜0.05或P＜0.01)，开放主动脉60 min时P组MDA和MSD差异均无统计学意义(P＞0.05)。阻断主动脉60 min、开放主动脉30 min和60 min时P组MDA和MSD均低于C组(P＜0.01)。见表1。

    3  讨  论

    线粒体损伤可引起一系列的细胞功能障碍，线粒体损伤与心肌细胞线粒体膜功能和抗氧化能力的表1  心肌线粒体SOD、GSH-PX、T-AOC、MDA和MSD的比较注：与ECC术前比较*P＜0.05，**P＜0.01；与C组比较 #P＜0.05

    改变有着密切的关系。心肌细胞线粒体肿胀度是评价线粒体膜通透性和流动性的敏感指标，提示线粒体肿胀度的变化在心肌细胞线粒体损伤的发生中的作用十分重要［4］。

    SOD、GSH-PX活力和MDA的含量既是反映抗氧化能力的重要指标，又可反映心肌缺血再灌注损伤的程度。研究证实，线粒体在氧化磷酸化过程中产生的氧自由基可被GSH-PX、SOD等清除，在一定程度上防止氧自由基及其介导的脂质过氧化反应引起的损害［5］。而ECC时，血液与人工管道的直接接触引起的血液激活是产生大量氧自由基的主要途径［6］。我们发现，对照组心肌缺血后心肌细胞线粒体内MDA含量与线粒体肿胀度均明显增加，与此同时，抗氧化酶GSH-PX、SOD及T-AOC显著下降；开放主动脉后心肌细胞线粒体MDA含量与线粒体肿胀度未见进一步改善,相反较缺血期间进一步增加；GSH-PX、SOD和T-AOC继续下降，从而证实ECC和心肌缺血再灌注过程中产生大量氧化代谢产物造成线粒体抗氧化水平下降。开放升主动脉后虽然恢复心脏的血液循环，但大量的氧自由基所引发的脂质过氧化反应会消耗心肌细胞线粒体抗氧化酶类，导致线粒体氧化与抗氧化严重失衡，使其膜结构更易于受到氧自由基的攻击，导致线粒体的结构和功能都遭到破坏。所以改善缺血/再灌注过程中心肌线粒体氧化与抗氧化的动态平衡对于减轻线粒体膜损伤有重要意义。

    研究表明，心肌细胞线粒体膜脂质中的不饱和脂肪酸对氧自由基损伤非常敏感，易受自由基攻击而被氧化，产生脂类过氧化物，其主要分解产物是MDA［7］。MDA是脂质过氧化物中毒性最大的一种，它能与核酶分子中的氨基和含有游离氨基酸的蛋白质反应，形成交联产物，降低生物膜的流动性和通透性。ECC期间，机体MDA增高、抗氧化酶类(GSH和SOD)及T-AOC的降低反应了氧化应激的程度，通过测定线粒体MDA、GSH-PX、SOD及T-AOC可间接了解线粒体的损伤情况［8］。本研究从氧化应激和脂质过氧化反应入手，ECC中应用PDTC可增加心肌线粒体SOD、GSH-Px活性，降低线粒体MDA含量，在一定程度上清除氧自由基以及降低氧自由基的介导放大效应，使过度的脂质过氧化反应得到控制。提示PDTC可有效抑制氧自由基对线粒体膜的氧化损伤，提高线粒体抗氧化能力。

    本研究发现PDTC对线粒体膜结构有明显的保护作用，这种作用主要表现在开放主动脉后的过程中，P组线粒体肿胀度显著低于相应时点C组，并逐渐恢复至ECC前水平，说明ECC中PDTC对线粒体膜等均有很好的保护作用，这可能是由于PDTC与膜中不饱和脂肪酸竞争性地与脂过氧基结合以直接阻断脂质过氧化的链式反应，减低脂质过氧化速率；再者，PDTC能插入到有不饱和脂肪酸存在的生物膜，使得含有不饱和脂肪酸的膜具有更大的稳定性［9］。本研究证实，ECC期间和心肌缺血再灌注过程中随着氧自由基的释放，心肌细胞线粒体的氧自由基反应和脂质过氧化反应呈现病理性变化，表现为线粒体抗氧化水平降低，线粒体膜结构的完整性损害。而PDTC对缺血再灌注心肌线粒体功能有保护作用，主要表现在PDTC可有效提高线粒体抗氧化酶的活性，清除氧自由基，降低过氧化脂质含量，加速低温缺血心肌细胞线粒体抗氧化能力的恢复，可有效抑制自由基对线粒体膜的氧化损伤。

【】
  ［1］ Kavianipour M,Ronquist G,Wikstrom G,et al.Ischaemic preconditioning alters the energy metabolism and protects the ischaemic myocardium in a stepwise fashion［J］. Acta Physiol Scand,2003,178(2):129-137.

［2］ Mallet RT,Sun J.Antioxidant properties of myocardial fuels［J］.Mol Cell Biochem, 2003, 253 (1-2):103-111.

［3］ Shlafer M,Gallagher KP,Adkins S.Hydrogen peroxide generation by mitochondria isolated from regionally ischemic and nonischemic dog myocardium［J］.Basic Res Cardiol, 1990, 85 (4): 318-329.

［4］ Athanasiou A, Smith PA, Vakilpour S,et al.Vanilloid receptor agonists and antagonists are mitochondrial inhibitors: How vanilloids cause non-vanilloid receptor mediated cell death［J］. Biochem Biophys Res Commun,2007,354(1):50-55.

［5］ Oz E, Erbas D, Surucu HS,et al.Prevention of doxorubicin-induced cardiotoxicity by melatonin［J］.Mol Cell Biochem,2006,282(1-2):31-37.

［6］ Chen YF,Tsai WC,Lin CC,et al.Effect of leukocyte depletion on endothelial cell activation and transendothelial migration of leukocytes during cardiopulmonary bypass［J］.Ann Thorac Surg,2004,78(2):634-642.

［7］ Anoopkumar-Dukie S, Walker RB, Daya S.A sensitive and reliable method for the detection of lipid peroxidation in biological tissues［J］.J Pharm Pharmacol,2001,53(2):263- 266.

［8］ Cancherini DV,Queliconi BB, Kowaltowski AJ.Pharmacological and physiological stimuli do not promote Ca2+-sensitive K+ channel activity in isolated heart mitochondria［J］.Cardiovasc Res,2007,73(4):720-728.

［9］ Wang LZ, Li ST, Wang YT,et al.Antioxidant attenuates acute lung injury after cardiopulmonary bypass in rats ［J］.Asian Cardiovasc Thorac Ann,2007，15(1):2-8.