PCNA、Bcl?2和Bax在喉癌组织中的表达及其意义

                    作者：李正贤，刘庚勋，刘阳云，颜美荣

【摘要】  目的 检测喉鳞状细胞癌组织中PCNA、Bcl?2和Bax的表达水平，探讨PCNA、Bcl?2和Bax在LSCC发病机制中的作用。方法 采用免疫组化Elivision法检测30例喉鳞状细胞癌、10例声带非典型增生中PCNA、Bcl?2和Bax的表达水平。结果 30例喉鳞状细胞癌中PCNA、Bcl?2和Bax的阳性表达率分别为96.6%(29/30)，93.3%(28/30)和60%(18/30)，声带非典型增生中PCNA、Bcl?2和Bax的阳性表达率分别为60%(6/10)，30%(3/10)和70%(7/10)。PCNA和Bcl?2阳性表达两组间差异有统计学意义，P<0.05，而Bax阳性表达两组间差异无统计学意义，P>0.05。结论 喉鳞状细胞癌的发生可能与PCNA的高表达和Bcl?2与Bax表达失衡有关，可能是细胞异常增生和凋亡失衡的共同结果

【关键词】  PCNA；Bcl?2；Bax; 喉肿瘤; 鳞状细胞癌；凋亡；免疫组织化学

    Abstract： Objective  To study the expressions of PCNA, Bcl?2 and Bax in laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC) and their roles.Methods  Immunohistochemical Elivision method was used to examine the expressions of PCNA, Bcl?2 and Bax in 30 cases of LSCC and 10 cases of vocal cords atypical hyperplasia (VCAH).Results  The positive rates of PCNA, Bcl?2 and Bax were 96.6%, 93.3% and 60.0% in LSCC, and 60.0%, 30.0% and 70.0% in the VCAH, respectively. There were significant differences in the expressions of Bcl?2 and PCNA between LSCC group and VCAH group (P<0.05). There was no significant difference in the expression of Bax  between the two groups (P>0.05).Conclusion  The over?expression of PCNA, as well as the unbalance between Bcl?2 and Bax, may be a positive factor in the pathogenesis of LSCC. It is suggested that LSCC development may result from a co?operation of abnormal proliferation and unbalanced apoptosis.

    Key  words： proliferation cell nuclear antigen; Bcl?2; Bax; laryngeal neoplasm; squamous cell carcinoma; apoptosis; immunohistochemistry

    喉鳞状细胞癌（Laryngeal squamous cell Carcinoma，LSCC）的形成是一非常复杂的过程，与多个基因或多个分子水平变化密切相关。细胞失控性增殖与凋亡异常可能是肿瘤发生的原因之一。我们应用免疫组织化学Elivision法检测LSCC组织中凋亡相关基因Bcl?2、Bax和表示细胞增殖指标的PCNA的表达,旨在探讨PCAN，Bcl?2和Bax基因产物在LSCC发病机制中的作用。为LSCC的基因提供新依据。

    1  资料与方法

    1.1  一般资料  选择本院1995—2005年门诊及住院的30例初发的进行期LSCC患者的手术标本。本组病例中男27例，女3例,平均年龄57.3岁，临床分型：声门上型3例，声门型25例，声门下型2例；临床分期按国际抗癌协会1997年修订的TNM分类及分期：T1 4例，T2 15例，T3 9例，T42例；N0 19例，N1 7例，N2 4例；Ⅰ期2例，Ⅱ期19例，Ⅲ期6例，Ⅳ期3例；组织学分级：高分化鳞癌18例，中分化鳞癌7例，低分化鳞癌5例。对照组为同期手术的10例声带非典型增生（vocal cords atypical hyperplasia，VCAH），平均年龄45.6岁。标本经10%甲醛固定,常规脱水、石蜡包埋。

    1.2  方法  标本经固定后，常规脱水石蜡包埋，作3 μm 连续切片，分别进行HE染色和免疫组织化学染色。切片脱蜡至水化，3％过氧化氢孵育10 min ，消除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水冲洗，PBS浸泡3×2 min，微波炉抗原修复（95～98 ℃），冷却至室温，加入即用型Bcl?2、Bax和1：100PCNA单克隆抗体，37 ℃ 孵育30 min，或4 ℃ 过夜，用普通小鼠IgG及PBS代替一抗作阴性及空白对照，PBS冲洗3×2 min，滴加增强剂（A），37 ℃  孵育30 min，PBS 冲洗3×2 min，滴加生物素聚合物（B），37 ℃ 孵育30 min，PBS 冲洗3×2 min。二氨基联苯胺显色，苏木素复染，中性树胶封片，显微镜观察照相。

    1.3  染色结果判断 阳性细胞为呈棕黄色颗粒的阳性反应产物。每张切片在高倍显微镜下(200倍)随机选择5个视野，每个视野阳性细胞率，取平均值作为该标本的阳性细胞率。表达结果分为阴性（-）：无阳性细胞；弱阳性（+）：阳性细胞率<50%；强阳性（++）：切片中阳性细胞率>50%。

    1.4  统计学方法  结果应用χ2检验进行统计学分析。所有数据在SPSS11.0统计软件上进行，以P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结果

    2.1  Bcl?2、Bax在LSCC及VCAH中的表达(表1)  光镜下观察，LSCC上皮细胞中胞浆、胞膜呈棕黄色染色的细胞为Bcl?2、Bax阳性细胞,片状分布于上皮层及上皮下纤维层，但主要见于上皮基底层，VCAH中仅有3例见到Bcl?2阳性表达，而Bax阳性表达较高。Bcl?2在LSCC中棕黄色颗粒可见于胞浆、胞膜内，呈均匀分布，但主要见于上皮基底层染色， VCAH中未见到Bcl?2表达染色，Bax在LSCC上皮中可见棕黄色颗粒均匀分布，VCAH 上皮中Bax阳性物质可见于胞浆、胞膜内。表1  Bcl?2、Bax在LSCC及VCAH中的表达情况与声带非典型增生组比较,①χ2=19.40 P<0.001,②χ2=0.32 P>0.05,③χ2=9.20  P<0.005

    2.2  PCNA在LSCC及VCAH中的表达(见表1)  光镜下观察,棕黄色阳性颗粒位于细胞核，阳性细胞分布不均，癌巢周边及浸润前缘细胞密集，癌巢中央特别是有明显角化的细胞表达低。

    2.3  由表1可见  LSCC中Bcl?2和PCNA蛋白表达与VCAH对比差异有统计学意义；Bax蛋白表达在两组间对比则差异无统计学意义，表明LSCC中存在Bcl?2与Bax表达失衡和PCNA的高表达。

    3  讨论

    近年来关于LSCC发病机制的研究已取得较大进展，但学说颇多,确切机制至今尚未阐明，我们通过对PCNA、Bcl?2和Bax在LSCC表达的观察,旨在进一步探讨其发病机制。PCNA是真核细胞DNA合成所必需的一种相对分子质量为36 000的核蛋白，是DNA多聚酶的辅助蛋白，是细胞DNA合成期的必需物质，是一种细胞增殖状态的理想标志物[1]。在静止细胞中PCNA含量很少，G1晚期开始增加，S期达到高峰，G2期下降，M期测不到。因此认为 PCNA与细胞增殖活动密切相关，可作为一种准确、简便、直观研究评价细胞增殖状态的重要指标，我们的研究结果显示LSCC中PCNA 表达增高，明显高于VCAH，提示LSCC内存在明显的细胞增殖和活跃的物质合成。可能与LSCC的发生有关。

    细胞凋亡与肿瘤的关系是近年来的研究热点之一。细胞凋亡的失控是否导致LSCC的发生发展，备受人们关注，成为目前的研究重点。Bcl?2和Bax是该家族中的重要成员，它们主要通过线粒体途径参与凋亡调控，当细胞受到死亡信号刺激，与Bcl?2蛋白相结合的蛋白就会被置换出来,线粒体膜通透性增加,释放出一系列物质，最终导致细胞死亡[2～4]。

    Bcl?2和Bax是凋亡密切相关的基因，Bcl?2是最为熟悉的抑凋亡基因，而Bax则是促凋亡基因，二者的比例决定细胞接受凋亡信号后的存活与否。本实验中，Bcl?2在LSCC中多数表达阳性，且多见于上皮层，尤其是基底层，而VCAH多数表达阴性，Bax在LSCC与VCAH中的表达差异无统计学意义，提示在LSCC中Bcl?2和Bax表达失衡,过量表达的的Bcl?2抑制了Bax的作用,使得增生、分化活跃的上皮基底细胞正常的凋亡受到抑制[5]。导致了LSCC的发生发展。我们的研究结果发现，VCAH存在着Bax基因蛋白的表达, 组织的细胞增殖与凋亡处于平衡中；在LSCC中，Bcl?2与Bax的表达无相关,表明LSCC中凋亡抑制基因的启动以及异常的增殖并非是组织凋亡的自身平衡效应，而是受刺激后产生的病理反应，可能是由于吸烟、慢性炎症等刺激因素引起喉黏膜的蛋白变性及细胞因子的异常分泌,直接或间接通过某种信号启动凋亡抑制基因,使得上皮基底细胞正常的凋亡受到抑制,同时外界的刺激及其分泌的细胞因子引起的大量细胞增殖，同时也是细胞凋亡受抑制造成了细胞堆积。因此,我们认为，细胞的失控性增生与凋亡异常的共同作用在LSCC发生发展中有重要意义。进一步研究如何对细胞增殖与凋亡的有效调控对LSCC的预防、有重要的研究价值。

【】
  [1] 李晓光，于肖鹏，赵海兰，等.PCNA在口腔鳞癌中的表达及其临床意义[J].泰山医学院学报，2005,26（1）：20-22.

[2] Ozdek A, Sarac S, Akyol MU, et al. C?myc and bcl?2 Expression in supraglottic squamous cell carcinoma of the larynx[J]. Otolaryngol Head Neck Surg,2004,131(1): 77-83.

[3] 王海燕，黄爱民，高美钦.Survivin, Bcl?2和Bax蛋白在乳腺癌中的表达及其意义[J].解剖学杂志，2006,29（1）：61-64.

[4] Panasiuk A, Dzieciol J, Panasiuk B,et al.Prokopowicz D. Expression of p53, Bax and Bcl?2 proteins in hepatocytes in non?alcoholic fatty liver disease[J]. World J Gastroenterol, 2006,12(38):6198-6202.

[5] Condon LT , Ashman JN , Ell SR , et al. Overexpression of Bcl?2 in squamous cell carcinoma of the larynx: a marker of radioresistance[J]. Int J Cancer, 2002,100(4): 472-475.