iNOS、CD34在喉鳞状细胞癌组织中的表达与血管形成的关系

                       作者：李正贤，刘庚勋，颜美荣，刘阳云 

【摘要】  目的 探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和CD34在喉鳞状细胞癌中的表达及其发病过程中的作用。方法 采用免疫组化Elivision法检测30例喉鳞状细胞癌、10例声带非典型增生中iNOS和CD34的表达，并检测MVD。结果 30例喉鳞状细胞癌中iNOS的阳性表达率为80．33％(25/30)，声带非典型增生中iNOS的阳性表达率为10%(1/10)。CD34在喉鳞状细胞癌和声带非典型增生的阳性表达率分别为80％(24/30)，30％(3/10)。iNOS、CD34阳性表达两组间差异有统计学意义（P<0．025）。喉鳞状细胞癌和声带非典型增生中微血管密度(MVD)分别为43．45±10．06、21．34±6．31，两组间差异有显著统计学意义（P<0．001）。结论 iNOS、CD34在喉鳞状细胞癌中的高表达，提示iNOS、CD34可促进血管形成，可能与喉鳞状细胞癌的发生、及侵袭转移有关。因此，选择性抑制iNOS和CD34可望成为基因喉鳞状细胞癌的新思路。

【关键词】  诱导型一氧化氮合酶；CD34；喉鳞状细胞癌；血管形成；免疫组织化学

    Abstract： Objective  To investigate the expressions of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and CD34 and their roles in the occurrence, development and metastasis of laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC).Methods  The immunohistochemical Elivision method was used to examine the expressions of iNOS and CD34 in 30 cases of LSCC and 10 cases of vocal cords atypical hyperplasia (VCAH), and the microvascular density (MVD) was measured as well.Results  The positive rates were 80.33% vs 10% for iNOS, and 80% vs 30% for CD34, respectively in LSCC and VCAH. The MVD was 43.45±10.06 for LSCC, and 21.34±6.31 for VCAH. There were significant differences in the expressions of iNOS and CD34 and in MVD between LSCC and VCAH (P<0.05,P<0.001).Conclusion  There are high iNOS and CD34 expressions in LSCC which suggest new agniogensis, and iNOS and CD34 may play important roles in the incidence, development and metastasis of LSCC.

    Key  words： inducible nitric oxide synthase; CD34; laryngeal squamous cell carcinoma; angiogensis; immunohistochemistry

    近年来的研究发现，一氧化氮合酶(NOS)活性的增高与肿瘤血管生成有关[1～2]。喉鳞状细胞癌的发生发展及侵袭转移其发病机制目前仍不十分清楚，为探讨喉鳞状细胞癌的发生、发展和转移与新生血管化的关系，本研究通过检测喉鳞状细胞癌中iNOS和CD34的表达水平和检测微血管密度，探讨诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和CD34在喉鳞状细胞癌侵袭转移中的作用。

    1  材料和方法

    1．1  一般资料  选取本院1995—2005年经病理证实的喉鳞状细胞癌30例手术标本。本组病例中男27例，女3例，平均年龄57．3岁，临床分型：声门上型3例，声门型25例，声门下型2例；临床分期按国际抗癌协会1997年修订的TNM分类及分期：T14例，T215例，T39例，T42例；N019例，N17例，N24例；Ⅰ期2例，Ⅱ期19例，Ⅲ期6例，Ⅳ期3例；组织学分级：高分化鳞癌18例，中分化鳞癌7例，低分化鳞癌5例。对照组为同期手术的10例声带非典型增生(vocal cords atypical hyperplasia，VCAH)，平均年龄45．6岁。标本经10％甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋。

    1．2  方法  标本经固定后，常规脱水石蜡包埋，作3μm连续切片，分别进行HE染色和免疫组织化学染色。切片脱蜡至水化，3％过氧化氢孵育10 min，消除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水冲洗，PBS浸泡3次×2 min，微波炉抗原修复(95～98 ℃)，冷却至室温，加入1：100 iNOS和1：150 CD34单克隆抗体，37 ℃ 孵育30 min，或4 ℃ 过夜，用普通小鼠IgG及PBS代替一抗作阴性及空白对照，PBS冲洗3×2 min，滴加增强剂(A)，37 ℃ 孵育30 min，PBS冲洗3次×2 min，滴加生物素聚合物(B)，37 ℃ 孵育30 min，PBS冲洗3次×2 min。二氨基联苯胺显色，苏木素复染，中性树胶封片，显微镜观察照相。

    1．3  染色结果判断  阳性细胞为呈棕黄色颗粒的阳性反应产物。每张切片在高倍显微镜下(200倍)随机选择5个视野，每个视野阳性细胞率，取平均值作为该标本的阳性细胞率。iNOS、CD34表达结果分为:(1)阴性(-)：无阳性细胞或有散在阳性细胞，阳性细胞率<10％。(2)阳性(+)：切片中阳性细胞率>10％。按Weidner法进行微血管计数，任何被CD34染成棕黄色或棕褐色的内皮细胞或细胞簇作为一个微血管计数，这些血管之间必须要有清楚的分离，先在40倍光镜下挑选微血管分布最密区域，200倍视野下计数5个不重复视野中的阳性血管数，取其平均值作为每例的MVD。

    1．4  统计学方法  计数资料用率(％)表示，组间差异采用χ2、t检验；所有数据在SPSSl1．0统计软件上进行，以P<0．05为差异有统计学意义。

    2  结果

    iNOS主要表达于喉鳞状细胞癌组织细胞的细胞质和细胞膜内，少数表达于细胞核，iNOS表达阳性的细胞分布无明显，阳性细胞分布不均，癌巢周边及浸润前缘细胞密集，癌巢中央特别是有明显角化的细胞表达低。iNOS在喉鳞状细胞癌的阳性表达率为80．33％(25/30)。iNOS在声带非典型增生细胞内仅1例阳性表达，阳性表达率为10%(1/10)。iNOS在喉鳞状细胞癌及声带非典型增生的表达存在显著统计学差异(P<0．001)。CD34在喉鳞状细胞癌的阳性表达率为80％(24/30)。CD34在声带非典型增生细胞内的阳性表达率为30(3/10)。CD34在喉鳞状细胞癌及声带非典型增生的表达存在统计学差异(P<0．005)。喉鳞状细胞癌及声带非典型增生的微血管密度分别为43．45±10．06，21．34±6．31，两者相比有显著统计学差异（P<0．001）。表1  iNOS、CD34在喉鳞状细胞癌及声带非典型增生中的表达和微血管密度

    3  讨论

    一氧化氮(NO)是近年来发现的生物体内重要的细胞内信使分子，分子量极小，但在人体的生理、病理过程中起着重要作用，与多种疾病，特别是肿瘤的发生过程密切相关。一氧化氮合酶是催化NO生物合成的关键酶，在正常组织中很少表达，可由炎症、缺氧等刺激因素诱导巨噬细胞、炎性中性粒细胞及肿瘤细胞等产生。目前已知体内有3种NOS，其分别为神经型(nNOS)，内皮型(eNOS)和诱导型(iNOS)。nNOS、eNOS属于结构型NOS(constructiveNOS，cNOS)，其活性变化受Ca2+和钙调蛋白调节，又称钙离子依赖型。一般认为，cNOS催化生成的NO主要参与维持血管舒张和神经信息传递等；而iNOD不受Ca2+和钙调蛋白调节，生理状态下不具备活性，但在各种刺激因素下诱导活化，参与多种病理过程[2]。近年来人们在对NO与肿瘤生物学行为的研究中发现，NO合成关键酶NOS与肿瘤的生长有直接关系。  即在多种肿瘤细胞中存在活性增高的现象。NO可以促进肿瘤血管生成，增强肿瘤组织的血液供应，从而促进肿瘤细胞生长。喉鳞状细胞癌细胞异常增殖和凋亡。肿瘤血管形成是肿瘤生长和侵袭转移等生物学行为的病理基础，喉鳞状细胞癌的发生发展需要新生血管化参与，大量的血管形成是喉鳞状细胞癌向周边发展侵袭的必备条件。有研究表明VEGF、CD34在喉鳞状细胞癌组织中有高表达，与血管形成有关。本研究结果表明，iNOS在喉鳞状细胞癌中有高表达，提示iNOS参与了喉鳞状细胞癌的血管形成过程，可能与喉鳞状细胞癌的发生发展及侵袭转移有关。具体机制可能是iNOS催化产生的NO促进新生血管形成；或是iNOS及其催化产生的NO促进血管内皮生长因子形成，活性增高，通过与内皮细胞上的特殊受体作用，直接刺激内皮细胞分化增殖和迁移，促进血管构建及生成，加快基底膜降解，诱导内皮细胞细胞膜成窗，促进内皮细胞移动，即直接参与了血管形成过程；并通过增强血管通透性，促进血浆纤维蛋白外渗形成血管外纤维蛋白基质，为血管生成过程中多种细胞迁移提供一个纤维网架[3～5]。有研究证明，在角膜肿瘤血管模型研究显示，给兔饮用含有NOS抑制剂N?硝基?L?精氨酸的水后，肿瘤新生血管减少，体积缩小，敲除iNOS基因的小鼠接种B16?F1细胞后，成瘤率降低，并伴有VEGF表达降低[6]。   

    血管生成CD34存在于微血管的内皮细胞，它能通过抗体与其相应的血管内皮细胞结合，增加内皮细胞的化学趋向性，促进血管内皮的分裂和毛细血管出芽生长，诱导蛋白溶解酶生成，有利于内皮细胞穿过基质，促进新生血管形成[7～8]。因此，CD34被认为是血管最特异的标记物，因此CD34的含量变化直接反映了喉鳞状细胞癌血管的多少。本组的结果表明喉鳞状细胞癌的微血管密度明显高于声带非典型增生，提示喉鳞状细胞癌有明显的血管新生，在癌巢周边及浸润前缘血管新生更加明显，可能与喉鳞状细胞癌的侵袭转移有关，丰富的血管不仅增加了肿瘤细胞进入血液循环的几率，而且还可以沿邻近与毛细血管伴行的淋巴管，进一步促进经淋巴转移。   

    综上所述，iNOS和CD34在喉鳞状细胞癌组织中高表达，可能与喉鳞状细胞癌的发生发展及侵袭转移有关，同时也提示选择性NOS抑制剂可以阻断新生血管形成，从而影响喉鳞状细胞癌的发生发展和侵袭转移。

【】
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