地塞米松对大鼠肺缺血再灌注损伤保护的研究
作者：许文景 倪松石，黄冬云
【摘要】 目的:通过观察地塞米松对大鼠肺缺血再灌注后病理形态变化的影响，探讨其对肺缺血再灌注损伤的保护机制。方法:健康的SD大鼠40只，雌雄不拘，随机分为5组：假手术组（S）、单纯缺血组（I）、缺血再灌注组（IR）、小剂量地塞米松干预组（D1）及大剂量地塞米松干预组（D2），每组8只。根据Eppinger模型制作SD大鼠单侧肺缺血再灌注动物模型，用Western 印迹法分析各实验组中一氧化氮合酶蛋白表达的变化，HE染色观察肺组织病理形态学改变 结果: 与其它组比较，缺血再灌注组肺组织中蛋白一氧化氮合酶表达明显增高（P＜0.01)，在地塞米松干预后，一氧化氮合酶蛋白下降，以D2组明显，病理切片显示IR 组肺结构损害分级显著重于其它组，在地塞米松干预后， 肺结构损害分级下降，以D2组明显。结论:正常肺脏一氧化氮合酶蛋白的表达微弱, 缺血再灌注可使一氧化氮合酶蛋白表达增加，肺组织损伤加重，地塞米松可使一氧化氮合酶蛋白表达下降，肺组织损伤减轻，这种效应以大剂量时明显。
【关键词】 缺血再灌注；肺； 地塞米松；一氧化氮合酶；大鼠
[Abstract] Objective: To explore the protective effect of Dexamethasone by observing the diversity of pathological appearance in the case of ischemia-reperfusion-induced pulmonary injury before and after the intervention of Dexamethasone in rats. Methods: 40 healthy Sprague-Dawley rats were chosen without considering of their sexes, and divided randomly into five groups: sham group（S）, ischemia-only group（I）, ischemia-reperfusion group （IR）, small-dose Dexamethasone interfered group （D1）, and large-dose dexamethasone interfered group（D2）, with eight in each group. Rat model of warm ischemia and reperfusion in situ in single lung was prepared on the basis of Eppinger Model. The protein of inducible nitric oxide synthase (iNOS )in lung tissue was detected by Western-blot. Pulmonary pathological changes were observed by H-E staining. Result: Compared with other groups, the expression of iNOS protein in Group IR was much higher(P＜0.01),which decreased after the intervention of Dexamethasone，especially in large dose. The pathological section showed that the pulmonary structural lesion was more serious in Group IR, and after intervention, the structural lesion was lessened .Conclusion: The expression of iNOS protein in normal lung is little ,but if the lung is ischemia-reperfusioned,the iNOS protein increases obviously while the lung injury is obvious. After the intervention of Dexamethasone，especially in large dose,the iNOS protein declines and the lung injury lessens.
[Key Words] Ischemia-reperfusion; Lung; Dexamethasone; Inducible nitric oxide synthase; Rat
近年来肺栓塞溶栓、肺动脉血栓内膜剥除术、肺移植、体外循环手术等心胸外科手术得到广泛开展。随之而来的肺外组织器官缺血再灌注所致的肺组织损伤情况也增多，肺缺血－再灌注损伤的问题逐渐受到重视。Shang 等[1]研究表明无论是内源性或是外源性NO对缺血再灌注肺皆有损伤作用。Zhou等[2]研究表明肺外组织缺血再灌注时可使肺内经由诱导型一氧化氮合酶（iNOS）所调控的一氧化氮（NO）过度表达，从而导致炎性介质过氧化亚硝酸盐在肺内积聚引起肺损伤，以上研究提示抗炎治疗在抗肺缺血再灌注损伤方面有着良好的应用前景。地塞米松具有强大的抗炎作用,通过阻断炎症因子级联反应及抑制趋化因子从而减少中性粒细胞向组织聚集,减轻局部炎症反应；本研究选用地塞米松对大鼠肺缺血再灌注过程进行干预并探讨其保护机制，从而为临床治疗提供佐证。
1 材料和方法
1.1 动物分组 健康SD大鼠40只，雌雄不分，体重250~350 g，由南通大学医学院实验动物中心提供。随机分成5组：假手术组（S组）、单纯缺血组（I组）、缺血再灌注组（IR组）、小剂量地塞米松干预组（D1组）、大剂量地塞米松干预组（D2组），每组8只。
1.2 实验方法 根据Eppinger方法建立动物模型，假手术组仅开胸不阻断左肺门，单纯缺血组仅阻断左肺门2 h，不予再灌注。缺血再灌注组、小剂量地塞米松干预组（D1组）、大剂量地塞米松干预组（D2组）均阻断左肺门1 h后，给予再灌注2 h。D1和D2组在再灌注前5分钟经尾静脉或阴茎背静脉分别注入地塞米松1 mg/kg、5 mg/kg。各实验组模型制备完成后放血处死大鼠，左肺上部用4%多聚甲醛固定作病理检查，下部放入液氮保存作western-blot检测。
1.3 检测观察方法 （1）Western blot： 取肺组织提取液蛋白50 μg，用12%SDS-PAGE 凝胶电泳分离,将电泳条带转移至醋酸纤维膜上，1∶500 稀释一抗iNOS（购自武汉博士德公司，产品批号：BA-0362） 。二抗为辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体（购自武汉博士德公司，产品批号：BA1054）。用ECL 显色曝光，将胶片曝光结果扫描到机，用Quantity One软件进行条带灰度值分析。每次结果以对照组灰度值为，其他组条带灰度与对照组之比为其相对值；（2）HE 染色： 固定、取材、梯度脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、复水、HE染色，观察肺组织学结构改变。
1.4 统计学方法 所有数据采用Stata8.0统计软件分析处理，计量资料以x±s表示，采用方差分析，两两比较用q检验。等级资料采用参照单位分析（Radit 分析），P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2．1 病改变 采用Egan肺组织学评分标准进行判断。Egan 肺组织学评分标准:正常,无损害;轻度:点状炎症；中度:血管周围及支气管周围水肿,血管充血及炎症;重度:肺泡及组织间隙水肿,严重的血管水肿及血栓形成。病理损害分级比较见表1。结果显示：假手术组大鼠肺组织结构正常，肺泡结构清晰，肺间质无充血、水肿，肺泡壁无增厚，肺泡腔无出血和中性粒细胞浸润（图1）；单纯肺缺血组见肺泡间质轻度水肿，少量炎症细胞的浸润，部分肺泡结构破坏（图2）；再灌注组肺间质水肿、增厚，肺泡腔内渗出，并有中性粒细胞浸润和肺组织结构的破坏（图3）；与IR组比较，地塞米松组肺泡结构破坏较IR组轻、炎症细胞浸润减少，细胞肿胀、水肿减轻，尤以大剂量组明显（图4、5）。
2.2 各组肺组织iNOS蛋白表达变化 检测各组肺组织iNOS光密度值，经β-actin的光密度值校正上样误差后，以相应正常对照组样本光密度为100%，分别计算各样本光密度值相对变化幅度代表iNOS蛋白表达的变化。图6和表2显示，正常肺组织iNOS蛋白表达很低，IR组表达明显升高。
3 讨 论
包括肺动脉栓塞在内的多种原因均可形成肺动脉血流不畅或血流中断，从而造成肺组织缺血以及肺损伤。尽早恢复缺血肺组织的血流，最大限度地降低肺组织损伤是临床医师追求的目标。但是肺动脉血流再通后亦有出现肺损伤甚至损伤加重的可能，即再灌注损伤。如何保证恢复肺动脉血流畅通又要防止或最大限度地减轻缺血再灌注损伤的发生成为临床医师关注的问题。
NO是具有广泛生物活性的信号分子，由于其独特的理化性质和生物学活性，NO在体内同时扮演着生理和病理的双重角色[3]。一方面作为重要的信使分子,小量NO的释放对维持血管生物学功能具有重要作用；另一方面NO作为一种自由基,又具有细胞毒性作用[4]。但在其究竟扮演有害的作用还是有利的作用上还存在很多争议。目前普遍认为，经由高表达的iNOS途径产生的过量NO，是缺血再灌注损伤发病机制中一个重要的组成部分[2]，iNOS在正常状态下不被激活，但在缺血再灌注过程中，特别是在再灌注2 h内可被诱导激活而产生过量的NO。而过量的NO可介导细胞毒性和促进肺泡细胞凋亡从而引起肺损伤[5]。本实验也证明在IR时，肺组织中iNOS表达明显增高，同时肺组织损伤明显，iNOS的表达高低与肺损伤的程度成正相关。
以上研究结果提示抗iNOS在肺缺血再灌注损伤中应用的良好前景。地塞米松通过调节炎症介质的活性和减少中性粒细胞活化、聚集等机制在肺组织内发挥其强大的抗炎作用[6]，已广泛应用于实验和临床。本课题选择大小两种不同剂量地塞米松对肺IR进行干预，取得了很好的肺保护作用，提示地塞米松为iNOS的良好抑制剂。分析其机制可能有：（1）阻断精氨酸转运和抑制四氢生物喋呤的生物（参与iNOS合成的必需辅助因子）合成[7]；（2）阻止iNOS mRNA的表达[8]；（3）促进iNOS蛋白的降解等[9]。
综上所述，地塞米松抑制iNOS蛋白表达， 从而起到对缺血再灌注肺组织的保护作用。当然我们的研究仅局限于动物，而过渡到人体尚需要更多更深入的研究。
【】
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