细胞外信号调节激酶在脂多糖诱导内皮细胞β-1,4-半乳糖基转移酶-I表达中的作用

             作者：贲志云，程纯，钱佶，肖锋，张福鹏，季玉红

【摘要】  目的：研究细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated protein kinase, ERK）对脂多糖（LPS）诱导内皮细胞β-1,4-半乳糖基转移酶-I（β-1,4-galactosyltransferase-I, β-1,4-GalT-I）表达的调节作用。方法：应用ERK通路抑制剂U0126预处理人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）2 h，再用LPS刺激HUVECs 4 h，分别用RT-PCR和Western-blot 方法检测β-1,4-GalT-I mRNA 及蛋白水平表达变化，并通过内皮-单核细胞黏附试验观察HUVECs黏附能力的改变。结果：U0126显著抑制LPS引起的HUVECs β-1,4-GalT-I表达的上调及其黏附能力的上调。结论：ERK信号转导通路可能参与调节LPS诱导的内皮细胞β-1,4-GalT-I的表达，并影响内皮细胞的黏附能力。

【关键词】  细胞外信号调节激酶；脂多糖；β-1,4-半乳糖基转移酶-I；内皮细胞

    [Abstract]   Objective: To investigate the role of extracellular signal-regulated protein kinase(ERK) in regulating the expression of β-1,4-galactosyltransferase-Ⅰ（β-1,4-GalT-Ⅰ）stimulated by lipopolysaccharide (LPS)in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs). Methods: Cultured HUVECs were pretreated by U0126, an inhibitor of ERK, for 2 hours, and then stimulated by LPS for 4 hours. The changes of β-1,4-GalT-ⅠmRNA expression were detected by RT-PCR and Western blotting, and adherence ability of HUVECs was observed by Endothelial-monocyte cell adherence test. Results: Up-regulated expression of β-1,4-GalT-Ⅰ in HUVECs and adherence ability of HUVECs enhanced by LPS were significantly suppressed by U0126. Conclusion: ERK signal transduction pathway may participate in regulating β-1,4-GalT-Ⅰ expression in endothelial cells (EC) stimulated by LPS and influence the adherence ability of EC.

    [Key words]   ERK; LPS; β-1,4-galactosyltransferase–I; endothelial cell

    β-1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ（β-1,4-galactosyltransferase-Ⅰ, β-1,4-GalT-Ⅰ）是目前人们研究最广泛的糖基转移酶之一，在细胞中，它既能定位于高尔基体参与催化糖链合成，又能定位于细胞膜表面发挥细胞黏附作用。有研究表明，β-1,4-GalT-Ⅰ与炎症反应关系十分密切，β-1,4-GalT-Ⅰ基因敲除的小鼠急性和慢性炎症反应均受到抑制，而且募集至炎症部位的包括中性粒细胞和巨噬细胞在内的白细胞数目明显减少[1]。本实验室研究发现：在腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）所致的大鼠全身炎症反应及皮肤创伤所致的局部炎症反应中，β-1，4-GalT-Ⅰ表达均增加且与血管内皮细胞共定位[2, 3]；LPS诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）β-1,4-GalT-Ⅰ表达增加且具有剂量和时间依赖关系。而关于炎症刺激内皮细胞引起β-1,4-GalT-Ⅰ表达增加的调节机制，目前尚不清楚。

    细胞外信号调节激酶（extracellular signal -regulated protein kinase，ERK）是丝裂原激活蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases，MAPKs)家族的成员之一，ERK的活化是将信号从表面受体传导至细胞核的关键步骤。ERK信号转导通路是LPS信号转导通路的一条重要通路，ERK的活化与核移位经常被看作是细胞对LPS的刺激有反应的标志[4]。本研究中我们应用ERK抑制剂U0126检测使用前后β-1,4-GalT-Ⅰ表达变化，初步探讨 ERK对LPS诱导内皮细胞β-1,4-GalT-Ⅰ表达的调节作用。

    1   材料和方法

    1.1   主要试剂   LPS、U0126为Sigma公司产品；TRizol试剂为Invitrogen公司产品；DMEM培养基、RPMI1640培养基购自Gibco BRL公司；山羊抗β-1，4-GalT-I多克隆抗体、生物素标记的兔抗山羊IgG购自Santa Cruz公司。

    1.2   细胞培养与分组   人脐静脉内皮细胞株及人单核细胞株（U937）均购自院上海细胞生物研究所，分别用含10%小牛血清的DMEM完全培养基和含10%小牛血清的RPMI1640完全培养基在37 ℃，5％CO2培养箱中进行培养。取生长良好、传代稳定的HUVECs进行实验，将细胞分成4组：(1)正常对照组；(2)LPS刺激组：100 ng/ml LPS孵育细胞4 h；(3)U0126组：20 μmol/L U0126孵育细胞2 h；(4)U0126+LPS组：20 μmol/L U0126孵育细胞2 h后，加入100 ng/ml LPS继续孵育细胞4 h。  

    1.3   RT-PCR   采用 TRizol法提取各组HUVECs总 RNA，逆转录合成cDNA。根据GenBank登录的人类β-1,4-GalT-Ⅰ基因的全长cDNA序列（GD29805），采用Primer 5软件设计相应引物,引物由上海生工生物工程公司合成。所用引物序列为上游引物：GCAGAACCCAAATGTGAAG，下游引物：TGTGCCGTGGCTGTGAAAA，预期扩增产物长度为338 bp。设定反应条件为：93 ℃ 3 min，预变性后，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30s，72 ℃ 40 s，30个循环后，72 ℃延伸7 min。取10 μl PCR产物行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯下观察、拍照。

    1.4   Western-blot   收集各组细胞用冷PBS洗涤3次；加入细胞裂解液约100 μl，用细胞刮刮下细胞, 移入1.5 ml离心管，冰浴10 min；煮沸10 min，冰浴3 min；4 ℃，12000 rpm离心10 min，收集上清，用紫外分光光度仪测定蛋白质含量，分装，-70 ℃保存。从相应蛋白样品中取等量的蛋白煮沸5 min后，加样进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离的蛋白质转印至PVDF膜后放入含10％脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h，转入含10％脱脂奶粉的TBST稀释的一抗（山羊抗β-1,4-GalT-Ⅰ抗体）中，4 ℃过夜，TBST洗膜后放入用10％脱脂奶粉的TBST稀释的生物素标记的兔抗山羊IgG二抗中，室温2 h，TBST洗膜后加入ECL暗室内转印膜对X感光胶片曝光，显影和定影。

    1.5   内皮-单核细胞黏附实验   将96孔板中生长成的单层HUVECs细胞培养上清弃去，以预热的D-Hanks液洗涤2次，在每孔中加入200 μl 37 ℃预热的培养基，并按分组分别加入处理试剂，置37 ℃，5％CO2培养箱中，将生长状态良好的U937细胞离心洗涤，以RMPI1640培养基调配成5×104个/ml的单细胞悬液，置37 ℃，5％CO2培养箱中备用，将刺激完毕的HUVECs细胞从培养箱中取出，弃去上清，以预热的D-Hanks液洗涤2次，每孔加入200 μl上述浓度的U937细胞悬液，置37 ℃，5％CO2培养箱孵育0.5 h，取出，倒置培养板于吸水纸上，吸除上清，用200 μl D-Hanks液轻轻洗涤2次，以冲洗掉未黏附的单核细胞，高倍镜下计数每个复孔中随机1个视野中黏附的U937细胞数。

    2   结      果

    2.1   U0126对LPS诱导的HUVECsβ-1,4-GalT-Ⅰ表达的影响   RT-PCR结果显示LPS刺激组与正常对照组相比， β-1,4-GalT-ⅠmRNA表达明显增加，而U0126对LPS引起的β-1,4-GalT-Ⅰ表达的上调有显著抑制作用（图1）。Western-blot结果显示，β-1,4-GalT-Ⅰ蛋白水平的变化与mRNA水平的变化相一致（图2）。

    2.2   U0126对LPS诱导的HUVECs黏附能力的影响   内皮-单核细胞黏附实验结果显示，未处理HUVECs黏附的单核细胞较少，LPS处理HUVECs之后，黏附于HUVECs之上的单核细胞数目明显增加，而U0126可以明显抑制LPS诱导的内皮-单核细胞黏附能力的上调（图3）。

    3   讨      论

    目前认为，LPS损伤内皮细胞的信号转导途径主要包括NF-κB通路和MAPK通路[5]。在哺乳类动物细胞中已鉴定出MAPK信号转导通路主要有： ERK、 p38 MAPK通路、c -Jun氨基末端蛋白激酶( c-Jun N-terminal kinasa， JNK)[6]。其中，ERK的活化不是将信号从表面受体传导至细胞核的关键步骤，并且ERK的活化与核移位经常被看作是细胞对LPS的刺激有反应的标志[4]。

    β-1,4-GalT-Ⅰ是β-1,4-半乳糖基转移酶家族已经确认的7个成员中最早被成功克隆的[7]。我们研究发现，β-1，4-GalT-1可通过影响CyclinD1、p16INK4和p19ARF的表达而调节雪旺氏细胞的增殖[8]，LPS诱导HUVECs β-1,4-GalT-Ⅰ表达增加，且具有剂量和时间依赖关系。本研究中我们应用ERK通路抑制剂U0126检测ERK对LPS诱导内皮细胞β-1,4-GalT-Ⅰ表达的调节作用，发现U0126显著抑制LPS诱导的内皮细胞β-1,4-GalT-Ⅰ表达的上调，提示ERK信号转导通路可能参与调节LPS诱导的内皮细胞β-1,4-GalT-Ⅰ的表达。

    炎症因子刺激内皮细胞，引起内皮细胞活化，黏附分子表达增加，尤其是ICAM-I、VCAM-Ⅰ、E-选择素等表达上调，诱导单核细胞与内皮细胞黏附增加，从而穿出内皮细胞[9,10]。众多研究表明细胞表面β-1,4-GalT-Ⅰ与相邻细胞膜上或细胞外基质中糖复合物糖链末端的N-乙酰氨基葡萄糖或半乳糖基结合是细胞与细胞间以及细胞与细胞外基质之间发生黏附的重要原因[11,12]。本研究中我们发现U0126可以明显抑制LPS诱导的内皮-单核细胞黏附能力的上调，分析其原因可能与U0126抑制β-1,4-GalT-Ⅰ的表达，进而影响LPS引起的内皮细胞黏附能力的改变有关。

【】
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