MPTP诱导的小鼠帕金森病模型中相关脑区iNOS时程表达变化
作者：董玉林，张志军，刘 娟，郁晓燕，倪衡建
【摘要】 目的：观察1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱导的小鼠急性损伤PD模型中纹状体（CPu）、黑质致密部（SNpc）、额叶皮层联合区（FrA）和腹侧被盖区（VTA）中iNOS基因和蛋白的时程表达变化。方法：用RT-PCR和Western blot方法对MPTP诱导的小鼠PD模型中相关脑区iNOS基因和蛋白的表达量进行检测。结果：MPTP诱导的小鼠PD模型中SNpc和CPu脑区iNOS基因和蛋白在给药后多个时间点均有显著性表达，其中1 d是表达高峰；VTA和FrA脑区iNOS基因和蛋白的表达没有SNpc和CPu脑区表达显著。结论：表达增高的iNOS可能对SNpc和VTA脑区DA能神经元及CPu和FrA脑区的DA能神经元末梢起了损伤作用，从而导致了DA能神经元的减少及其末梢退变的发生。
【关键词】 帕金森病；1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶；诱导型一氧化氮合酶；小鼠
[Abstract] Objective：To observe the time-course expression of iNOS mRNA and protein in CPu，SNpc，FrA and VTA of the MPTP model of PD. Methods: Semi-quantitative RT-PCR and Western blot methods were used to detect the expressions of iNOS mRNA and proteins in these four regions. Results: The expressions of iNOS mRNA and proteins in CPu and SNpc increased significantly at several time points in the MPTP model of PD，and a peak was observed on day1.The expressions of iNOS mRNA and proteins in VTA and FrA increased less than those in CPu and SNpc. Conclusion: The increase in iNOS expression may damage the dopaminergic neurons in SNpc and VTA and the dopaminergic terminals in CPu and FrA.
[Key words] Parkinson’s disease （PD）；1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine；iNOS；Mouse
帕金森病（Parkinson’s disease，PD）典型的神经病理特征为：中脑黑质致密带（substantia nigra pars compacta，SNpc）中多巴胺（dopamine，DA）能神经元缺失导致纹状体（caudate putamen，CPu）中DA含量降低，而与其相邻的腹侧被盖区（ventral tegmental area，VTA）的DA能神经元却累及较轻[1]。何种分子机制导致PD患者DA能神经元退变至今仍不是很清楚，这也成为有效PD的一大障碍。本课题组之前通过每隔2 h按20 mg/kg给C57BL/6小鼠腹腔注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）1次，共注射4次的方法成功制作了小鼠PD模型，并观察到此模型中SNpc、VTA脑区的DA能神经元胞体以及CPu和额叶皮层联合区（Frontal association cortex，FrA）的DA能神经元末梢对MPTP所诱导的毒性反应不同。为证实这一现象是否与这些部位的诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表达量的不同有关，本文就MPTP诱导的小鼠急性损伤PD模型中SNpc、VTA、CPu、FrA等部位的iNOS基因和蛋白表达的时程变化差异进行探讨。
1 材料与方法
1.1 实验动物和主要试剂 成年雄性C57BL/6小鼠60只，体重28 g左右。由南通大学实验动物中心提供。MPTP（Sigma公司 M0896），Trizol Reagent （Invitrogen），DNA Marker DL2000 （TaKaRa：D501A），逆转录试剂盒（Fermentas﹟K1622），DNA聚合物， （TaKaRa），Mouse-anti-β-actin （AC-15） （ABCAM公司），Rabbit-anti-NOS2（M-19） （Santa Cruz公司），辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠、抗兔抗体（Pierce公司）。
1.2 实验动物分组 RT-PCR实验中我们选取了MPTP注射后6 h、1 d、3 d和14 d等4个时间点的小鼠为实验组（24只小鼠），对照组（6只小鼠）注射相同剂量的生理盐水；在Western blot实验中我们选取了MPTP注射后12 h、1 d、3 d和14 d等4个时间点的小鼠为实验组（24只小鼠），对照组（6只小鼠）注射相同剂量的生理盐水。
1.3 RT-PCR 将小鼠的脑取出后，取FrA、CPu、VTA和SNpc部位脑组织，取材范围：（1）FrA Bregma 3.20~2.80 mm；（2）CPu Bregma 0.98~0.14 mm；（3）VTA和SNpc Bregma -2.92~-3.64 mm，左右对称，用Trizol法提取总RNA，根据逆转录反应试剂盒说明书操作合成cDNA第一条链。以GAPDH为内参，各引物序列通过Primer 5.0软件设计，由上海生工生物技术工程有限公司合成。GAPDH基因上游引物5’-ATTCAACGGCACAGTCAA-3’；下游引物：5’-CTTCTGGGTGGCAAGTGAT-3’。iNOS基因上游引物：5’-GAGCGAGTTGTGGATTGTC-3’；下游引物：5’-CTCCTTTGAGCCCTTTGT-3’。用捷达凝胶成像分析系统对各脑区iNOS基因扩增电泳条带与相应的内参条带进行灰度扫描，以两者比值作为该脑区iNOS基因的相对表达量。
1.4 Western blot 将小鼠断头取FrA、CPu、VTA和SNpc部位脑组织，取材范围同RT-PCR操作，剪碎脑组织于裂解液中机械匀浆，4 ℃，12 000 rpm，离心15 min。紫外分光光度计测蛋白浓度（改良Lowry法），将各组蛋白浓度调到同一水平，-70 ℃冻存。制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%），样品加热变性后每孔加等量蛋白样品，电泳后湿转至硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉TBS缓冲液室温震荡封闭3 h后洗膜，加入TBS稀释的多克隆抗体一抗（β-actin抗体1∶10 000稀释；iNOS抗体1∶10 000稀释），4 ℃过夜，洗膜，加入TBS稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体（1∶1 000），室温孵育2 h，洗膜后加入ECL发光剂室温反应5 min，暗室用X感光胶片曝光显影后冲洗胶片。用捷达凝胶成像分析系统对各脑区iNOS蛋白条带与相应的内参条带进行灰度扫描，以两者比值作为该脑区iNOS蛋白的相对表达量。
1.5 统计学方法 每组数据分别与生理盐水对照组（Saline）进行对比，所得百分比再用Stata7.0统计软件进行单因素方差分析（ANOVA）。
2 结 果
2.1 RT-PCR检测结果
2.1.1 CPu和SNpc脑区iNOS基因琼脂糖凝胶电泳分析 iNOS基因在CPu和SNpc脑区时程表达变化较一致，MPTP注射6 h后，iNOS基因的表达即增高，与Saline对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）；MPTP注射1 d后，iNOS基因的表达增高达最高峰（P<0.001）；注射3 d后，iNOS基因的表达量有所下降，但与Saline对照组相比差异仍有统计学意义（P<0.001）；注射14 d后，其表达量很少，与Saline对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）（图1、2）。
2.1.2 FrA和VTA脑区iNOS基因琼脂糖凝胶电泳分析 iNOS基因在FrA和VTA脑区时程表达变化也较一致，但其表达量与CPu和SNpc脑区相比较少。MPTP注射6 h后，iNOS基因的表达稍有增高，但与Saline对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）；MPTP注射1 d后，iNOS基因的表达增高达到最高峰（P<0.01）；注射3 d后，iNOS基因的表达量下降，但与Saline对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）；注射14 d后，其表达量很少，与Saline对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）（图3、4）。
2.2 Western blot检测结果
2.2.1 CPu和SNpc脑区iNOS蛋白免疫印迹结果 iNOS蛋白在CPu和SNpc脑区时程表达变化较一致，MPTP注射后12 h就出现iNOS蛋白的表达增高，到1 d其表达量达到高峰，与Saline对照组相比差异均有统计学意义（P<0.001）；到3 d后，其表达水平有所下降，与Saline对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）；14 d后蛋白表达水平虽仍高于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05）（图5、6）。
2.2.2 FrA和VTA脑区iNOS蛋白免疫印迹结果 iNOS蛋白在FrA和VTA脑区的时程表达变化也较一致，MPTP注射后12 h，iNOS蛋白的表达增高不显著，到1d其表达量达到高峰，与Saline对照组相比差异有统计学意义（P<0.01、P<0.001）；到3 d后，其表达水平下降，虽仍高于Saline对照组，但差异无统计学意义（P>0.05）（图7、8）。
3 讨 论
PD的病因及发病机制至今不详， Mosley等[2]提出神经炎症和氧化应激在PD发病机制中发挥很重要的作用。一氧化氮（Nitric Oxide， NO）是一种化学性质活泼的小分子气体递质。在体内，NO是以左旋精氨酸（L-Arg）为底物，在还原型辅酶Ⅱ（NADPH）、黄素核苷酸（FMN）、黄素腺嘌呤二核苷酸（FDA）及四氢生物蝶呤（BH4）等因子辅助下由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化产生。目前NOS可分为3种亚型：神经元型NOS（nNOS）、内皮型NOS（eNOS）和iNOS。iNOS在生理条件下很少表达或不表达，一旦人、大鼠和小鼠出现脑缺血、脑外伤、脑神经毒性损伤或炎症性损伤后，反应性神经胶质细胞就表达iNOS。此时产生的NO在多种神经系统疾病中发挥有害的作用，如脱髓鞘疾病、脑缺血和外伤疾病、神经退行性疾病（AD、PD、HD等）[3]。本课题组前期实验也表明，iNOS在脑外伤大鼠皮层的损伤区周围大量表达，主要表达于巨噬细胞、星型胶质细胞，极少数表达于神经元内[4-5]。用不同剂量MPTP诱导的小鼠PD模型中，都可观察到反应性的胶质细胞表达iNOS[6-8]。将iNOS基因敲除或使用iNOS抑制剂，DA能神经元能抵抗MPTP的神经毒性作用[6，8-9]。
本实验中我们观察到SNpc和CPu部位的iNOS的基因和蛋白在造模后早期表达就增强，并持续至第1 d达到高峰，在第3 d仍有较高表达，随后表达减少，与对照组差异无统计学意义。同时我们还观察了VTA和FrA部位iNOS基因和蛋白表达的时程变化，发现这两个部位iNOS的表达在造模后增高的幅度不显著。
据此我们推测在此MPTP诱导的小鼠急性损伤PD模型中SNpc和CPu部位高表达的iNOS可能对DA能神经元及其末梢起了损伤作用。VTA和FrA部位的DA能神经元及其末梢退变不明显，可能与该区iNOS表达不显著增高有关。本实验结果提示iNOS参与MPTP诱导的DA能神经元及其末梢的损伤过程，但是否来源于胶质细胞以及具体作用机制仍需进一步的实验去证明。这些结果为深入研究在PD过程中应用某些胶质细胞抑制剂及iNOS抑制剂或者是整个信号级联过程的一些媒介物进行药调节提供一定的理论依据。
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