健儿强身膏对哮喘豚鼠肺组织病理的影响
作者：朱顺星 刘云 刘春 鄂群
【摘要】 目的：观察健儿强身膏对支气管哮喘豚鼠模型肺组织病理的影响。方法：采用卵蛋白（OVA）致敏法制备豚鼠哮喘模型，将豚鼠随机分为6组，即空白对照组、模型组、阳性对照组、中药（高、中、低）3个剂量组，分别观察各组引喘潜伏期（T）、支气管和肺组织的病理及超微结构变化。结果：健儿强身膏3个剂量组均能延长豚鼠哮喘诱发潜伏期，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）；中药各剂量组上气道炎症及肺组织病理症状与模型组相比均有不同程度改善，其作用与剂量呈相关性，效果与地塞米松相似。结论：健儿强身膏能有效降低肺组织炎性细胞浸润，改善肺组织的病变化。
【关键词】 哮喘；健儿强身膏；豚鼠；肺组织病理
[Abstract] Objective: To observe the effect of Jianerqiangshen electuary on bronchial tube and pulmonary morphology of asthmatic guinea pigs. Methods: The asthmatic guinea pig model was established with the ovalbumin（OVA） challenge methods. Forty-eight guinea pigs were randomly divided into six groups: normal control group，asthma model group，DXM –treated group，three dose groups of Jianerqiangshen electuary. The effects of relieving asthmatic attacks were observed，and pulmonary morphology and ultramicrostructures were observed too. Results: Compared with the model group，Jianerqiangshen electuary groups could prolong the latent period of asthmatic attack significantly（P<0．05）. The quantity of inflammation germ cells in Jianerqiangshen electuary treatment groups was significantly lower than that in model groups．The diference between groups treated had a positive correlation with the dose of electuary. The effect of Jianerqiangshen electuary was as good as DXM . Conclusion: Jianerqiangshen electuary could reduce the inflammation germ cell in filtration and improve the condition in lungs.
[Key words] Asthma；Jianerqiangshen electuary；Guinea pig；Pulmonary pathology
哮喘是由多种细胞，如嗜酸性粒细胞（EOS）、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞及气道上皮细胞等和细胞组分共同参与的气道慢性炎症疾病，也是儿童期最常见的慢性疾病。目前，主要应用于临床的药物是缓解症状和控制发作的药物。长时间使用具有一定的副作用。而中医药在治疗哮喘方面具有效果显著稳定、药效持续时间长、副作用小、善于预防和治本的优点[1]。健儿强身膏是南通市中江苏省名中医鄂惠的效应方，在临床中能有效控制哮喘发作期症状，可使易感儿童呼吸道感染次数减少，哮喘的发病率下降。本实验旨在基于显著临床疗效的基础上，进行其药效学及作用机理的实验研究，观察其对哮喘豚鼠肺组织的病理变化，为中药防治哮喘提供一定实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 健康2月龄普通级豚鼠，体重240～320 g，雌雄不拘，由南通大学实验动物中心提供。实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2001-0011。实验期间分笼饲养于安静室内，光照，室温20～26 ℃，湿度40%～70%，饲喂全价颗粒料和新鲜蔬菜，每周换垫料1次。
1.1.2 药品及试剂 健儿强身膏口服液：由南通市中医院制剂室按制备工艺生产提供，每毫升相当于生药1 g[生产批文号：通制剂（2001）04—125]。药物主要组成成分：党参、炒白术、茯苓、炒白芍、山药、炒谷麦芽、焦楂曲、黄芪、黄精、南北沙参、菟丝子、山芋肉、桑葚子、女贞、生熟地、川断、陈皮、甘草、仙灵脾、天麦冬、蒸百部、红枣、浮小麦、法半夏、黄芩、补骨脂。阳性对照药：地塞米松磷酸钠注射液（江苏涟水制药有限公司，批号：0411171）。致敏剂：卵蛋白（OVA），上海伯奥生物科技有限公司，批号0050114。
1.1.3 主要仪器 PARIBOY超声雾化机，德国百瑞；密闭透明容器（320 mm×260 mm×200 mm），自制；奥林巴斯CX41显微镜，日本；形态图像分析系统，南京捷达公司；外科手术器械1套。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组及剂量 取符合实验要求的豚鼠48只，随机分成6组：空白对照组（正常组）、哮喘模型组、地塞米松治疗组：地塞米松1 mg/kg体重、健儿强身膏低剂量组：生药4 g/kg体重、健儿强身膏中剂量组：生药8 g/kg体重、健儿强身膏高剂量组：生药16 g/kg体重，每组8只。
1.2.2 造模及给药方法 按照国际上通用的方法，以经典的卵蛋白致敏和攻击复制动物模型[4]。除空白对照组外，其余各组动物每只分别腹腔注射10%卵蛋白生理盐水溶液1 ml致敏，于第15、16、17天，将豚鼠逐个放入自制密闭容器中，超声雾化机衡压喷入1%卵蛋白生理盐水溶液30 S任其自由吸入，观察豚鼠呼吸节律、深度、膈肌收缩及有无抽搐跌倒等呼吸道痉挛梗阻等症状。其强度可分为四级：Ⅰ：呼吸加剧；Ⅱ：呼吸困难，点头呼吸；Ⅲ：腹肌痉挛，抽搐；Ⅳ：翻滚跌倒甚至死亡。出现上述症状即为造模成功。此时立即取出动物，置通风处，换气。同时记录引喘潜伏期（T），并进行比较。潜伏期：从吸入1%卵蛋白生理盐水溶液到腹肌痉挛、抽搐的时间。从第18天开始给药。模型组每天给予生理盐水10 ml/kg灌胃，中药低、中、高各组按规定剂量灌胃，阳性对照组按1 mg/kg体重腹腔注射给药，连续给药18天。并与给药后第6、12、18天分别诱喘1次，同时记录哮喘发作潜伏期。空白组以生理盐水替代卵蛋白同步实验。
1.2.3 标本采集 最后1次给药后24 h内，每只豚鼠称重后用3%戊巴比妥钠1 ml/kg注射，麻醉后腹主动脉放血处死。迅速选取右肺中叶于4%多聚甲醛（含1‰DEPC）中固定48 h后，常规石蜡包埋，切片，苏木精-伊红（HE）染色，光镜观察。
迅速取火柴头大小的右下肺组织标本，用3%戊二醛固定，1%四氯化锇后固定，Epon-812树脂包埋，做超薄切片，醋酸铀、枸橼酸铅染色，透射电镜观察并照相。
1.3 统计学方法 所有数据均用x±s表示，SPSS12.0统计软件进行单因素方差分析， P<0.05、0.01示差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 健儿强身膏对哮喘豚鼠引喘潜伏期的影响 见表1。后，哮喘模型组引喘潜伏期与治疗前比较未见明显差异。
2.2 肺组织病理变化观察 正常组：细支气管黏膜上皮排列整齐，细支气管壁内未见炎性细胞浸润，平滑肌周围偶见Eos（图1A1-2）；哮喘组：细支气管黏膜上皮排列紊乱、增生明显，支气管黏膜及黏膜下层组织有大量的Eos、中性粒细胞浸润，支气管壁增厚，管腔狭窄，腔内有大量的上皮细胞脱落，组织黏膜充血水肿明显等典型的气道炎症表现（图1B1-2）；地塞米松治疗组：组织黏膜仍有比较明显的充血水肿等，但Eos浸润较哮喘组豚鼠明显减轻，可见到淋巴细胞等，腔内有少量的上皮细胞和炎性细胞。（图1C1-2）；健儿强身膏治疗组：与地塞米松治疗组相似，Eos浸润较哮喘组豚鼠明显减轻，可见淋巴细胞等，组织仍有充血水肿，腔内有少量的上皮细胞和炎性细胞。其中高、中剂量组支气管管腔扩大，肺泡间隔明显变薄，肺泡腔变大，肺泡区炎症细胞浸润明显减少（图1E1-2，1F1-2），中药低剂量组（图1D1-2）有所减轻。
2.3 肺组织电镜观察结果 正常组细支气管、肺泡壁及肺泡细胞等均正常。哮喘模型组可见嗜酸性粒细胞，可见EOS脱颗粒，颗粒中有特异性结晶核。肺泡壁扩张，毛细血管充血。肺泡Ⅱ型上皮细胞肿胀，部分空泡化，板层小体排空。健儿强身膏各治疗组病变较模型组均有不同程度的减轻（图2）。
3 讨 论
哮喘，中医认为素体肺、脾、肾三脏不足，痰饮留伏，是发病的主要内在因素，气候转变，寒温失调，接触异物，过食生冷咸酸，是发病的重要条件。中医在哮喘防治方案中，根据正虚痰伏辨证要点，“未发以扶正气为主，既发以攻邪为急”（《丹溪心法》），在缓解期扶脾益肾，补土生金，调其脏腑功能，去其生痰之因，以冀减轻和制止发作，临床上常用单味黄芪、玉屏风、六味地黄丸等作为免疫增强剂[2]，以期通过提高小儿的免疫能力，来减少小儿哮喘的发作。健儿强身膏，方源取之《太平惠民和剂局方》中的四君子汤，以四君子为主方，固本以益养脾肺，又适当加用了补肺补肾之品，起到调理脏腑、强筋健骨之效。医学研究表明，四君子汤可促进实验动物产生IL-1、IL-2及干扰素[3]，具有调节巨噬细胞的功能[4]。通过实验可以观察到健儿强身膏的3个剂量组均能延长致敏豚鼠的引喘潜伏期，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05），且治疗前后差异有统计学意义（P<0.05）。表明健儿强身膏对哮喘豚鼠具有一定的平喘功效。
目前病研究表明，支气管哮喘气道炎症的病理学改变主要表现在以下几个方面：（1）气道黏膜组织中可见大量的炎性细胞浸润，以嗜酸细胞(Eos)为主，其次是肥大细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等；（2）气道上皮损伤与脱落，纤毛细胞有不同程度的损伤脱落；（3）气道壁增厚，黏膜水肿，胶原蛋白沉着；（4）支气管黏膜下黏液腺增生，杯状细胞肥大、增生，气道内黏液分泌增加并储留在支气管内形成黏液栓；（5）气道平滑肌的肌层增生，基底膜变性增厚等[5-6]。其中嗜酸性粒细胞是哮喘炎症的关键细胞之一，且嗜酸性粒细胞浸润程度与哮喘病情的严重性相关[7-9]。其通过释放已经生成并储存在细胞内的炎症介质和新生炎症介质起作用，损伤气道上皮。上皮细胞坏死、脱落，暴露气道上皮神经末梢使之受损、引起胆碱能神经处于超敏状态；气道上皮损伤又使吸入的各种刺激物不能被及时排出并沉积在气道黏膜表面，使气道处于超敏状态[10]。
本实验研究发现：空白组的支气管和肺组织结构正常，管腔内无明显渗出物，支气管黏膜上皮完整，炎性细胞浸润少见。而哮喘模型组肺泡内有大量的炎性细胞浸润，支气管黏膜水肿扩张，管腔变窄；腔内可见有炎性渗出、脱落的上皮等，支气管壁及管周大量炎性细胞浸润呈袖套状。电镜观察显示模型组肺泡间隔明显增厚，细胞成份增多，基底膜增厚；肺泡Ⅱ型上皮肿胀，板层体排空，可见嗜酸性细胞脱颗粒，颗粒中有特异性结晶核，支气管平滑肌增生、肥大，肺泡壁毛细血管扩张、管壁增厚，内充满大量红细胞。其病理改变符合上述情况，证实模型的复制是成功的。
通过实验我们观察到地塞米松干预后Eos浸润明显减轻，病理改变明显。目前认为地塞米松影响Eos浸润的主要机制为抑制Eos的趋化和诱导嗜酸性粒细胞凋亡。地塞米松可作为多种炎症介质释放的抑制剂，而其中许多介质可诱导Eos的趋化，如PAF(血小板活化因子)、IL-5等。上皮细胞是Eos趋化因子的主要来源，亦是激素的主要靶细胞，其可使上皮细胞因子的表达显著下调[11]。Wallen等[12]体外实验表明地塞米松可显著阻止IL-5、IL-3等对Eos凋亡的抑制作用，加速Eos的凋亡。国内邓立力等[13]研究发现，地塞米松可以通过下调哮喘大鼠基质金属蛋白酶-9的表达，纠正MMP-9/TIMP-1的平衡，抑制哮喘模型气道平滑肌增生和气道壁增厚。
通过对病理切片的观察，可以发现经中药治疗后各剂量组上气道炎症及肺组织病理症状与模型组相比均有改善，其作用与剂量成正相关性。特别是大剂量组病理改变明显减轻，支气管周围和黏膜层及肺泡区结构基本正常，无明显炎性细胞浸润，气道、血管平滑肌及肺泡壁无明显增厚，肺泡腔无明显改变。证实健儿强身膏具有抑制气道、肺组织炎症作用，其作用效果类似地塞米松。
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