Fas、FasL在特发性血小板减少性紫癜患者T细胞亚群表达的研究
作者：洪丽，鲁田夫，吴立连，胡艳明
【摘要】 目的 探讨Fas、FasL在特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者T细胞亚群及血小板中的表达状况及其在ITP发病机制中的作用。方法 收集ITP患者及健康人群外周抗凝静脉血，分离纯化得T细胞和血小板。以PE标记的anti?CRTH2mAb和Cy5标记的anti?CD4、CD8mAb及FITC标记的anti?Fas、FasL mAb做三色流式细胞术，分析ITP患者Th/Tc、Th1/Th2、Tc1/Tc2细胞Fas、FasL表达的变化;以FITC标记的anti?Fas、FasL mAb作单色流式细胞术，分析ITP患者血小板Fas、FasL表达的变化。结果 与健康人群相比，ITP患者外周血Th、Th1、Th2细胞百分率均明显下降(P<0.05)，Tc、Tc1、Tc2细胞百分率均无明显变化(P>0.05);Th、Th1、Th2及Tc、Tc1、Tc2细胞Fas、FasL表达均明显升高(P<0.05);同时，ITP患者血小板Fas的表达明显升高(P<0.05)，而FasL的表达无明显变化(P>0.05)。结论 ITP患者存在免疫功能失调，T细胞亚群及血小板Fas、FasL表达异常可能与ITP患者免疫病理机制有关。
【关键词】 特发性血小板减少性紫癜;Fas/FasL;T细胞亚群;血小板
ABSTRACT：Objective To investigated the expression of Fas, FasL on T cell subsets and thrombocyte in patients with idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) and its role in ITP pathogenesis. Methods Anticoagulated venous blood by heparin was collected from idiopathic thrombocytopenic purpura patients and healthy people and T cells and thrombocytes were separated by Human CD3+ T cell enrichment column. The expression of Fas, FasL on T cell subsets was detected by immunofluorescence staining and three?color flow cytometry by Fas/CD4, FasL/CD4, Fas/CD8 and FasL/CD8 gating. The expression of Fas, FasL on thrombocytes was metried by immunofluorescence staining and mono?color flow cytometry by Fas and FasL gating. Results Compared with healthy people, the percentage of Th, Th1 and Th2 cells in peripheral blood of ITP patients was markedly decreased, and the expression of Fas, FasL on Th, Th1, Th2, Tc, Tc1 and Tc2 was significantly increased(P<0.05).Meanwhile, the expression of Fas on thrombocytes was also significantly elevated.Conclusion There is immunofunction disorder in ITP patients.,and the abnormal expression of Fas, FasL on T cell subsets and thrombocytes may involve in ITP immunopathogenesis.
KEY WORDS：Idiopathic thrombocytopenic purpura;Fas/FasL;T cell subsets;Thrombocyte
特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)是一种自身免疫性疾病，发病机制包括T、B细胞的异常活化和T细胞依赖性自身抗体的产生。以往的研究表明，ITP患者血小板的损伤主要与患者体内抗血小板相关抗体对血小板的损伤作用有关[1]。近年来，人们发现，ITP患者外周血激活的淋巴细胞增多、细胞凋亡不足与疾病的发生有关[2，3]。本研究旨在通过对ITP患者T细胞亚群及血小板Fas、FasL蛋白表达的检测，以分析T细胞亚群及血小板Fas、FasL表达异常对细胞凋亡及其在ITP发病机制中的可能作用。CRTH2是目前认为的Th2、Tc2特异性表达标志物[4]，我们应用PE标记的抗CRTH2单抗和Cy5标记的CD4、CD8作双色标记，分别以CD4+CRTH2+T、CD4+CRTH2+T、CD8+CRTH2-T及CD8+CRTH2+T细胞代表Th1、Th2、Tc1及Tc2细胞，以CD4+T、CD8+T细胞代表Th、Tc细胞。
1 材料与方法
1.1 研究对象
35例ITP患者来自咸宁学院附属第一、第二医院、咸安区人民医院，其中男16例，女19例，年龄2～40岁，均符合ITP诊断标准[5]，并于用药前取外周抗凝血;正常对照30例，为健康人群，排除ITP及其它自身免疫性疾病，其中男14例，女16例，年龄3～42岁。
1.2 试剂和仪器
Cy5标记的anti?CD4、CD8mAb及小鼠抗人IgG1为EB公司产品，PE标记的anti?CRTH2mAb及小鼠抗人IgG1为Miltenybiotec公司产品，FITC标记的anti?Fas、FasLmAb及小鼠抗人IgG1购自AC公司，流式细胞仪为Beckman公司产品(型号：EPICS?XL),T细胞分离富聚柱购自易莱锦生物公司，淋巴细胞分液购自AXIS?SHIELD公司。
1.3 方法
1.3.1 外周血T细胞及血小板的分离
无菌采集患者及正常健康人群外周静脉血5ml，肝素抗凝，以淋巴细胞分液得淋巴细胞，采用溶血素溶解红细胞，经T细胞分离富聚柱得纯化的T淋巴细胞，用20%的小牛血清RPMI?1640培养液调整细胞浓度约2×106。SABC免疫组化法检测其纯度大于98%，台盼蓝拒染法检测其活性大于95%。上述步骤所得血浆经洗涤后用20%小牛血清RPMI?1640培养液调整血小板浓度为2×106。
1.3.2 外周血T细胞亚群及Fas、FasL测定
取4支试管，各加入100μl T细胞悬液，4管分别加入anti?CD4?Cy5、anti?CRTH2和anti?Fas?FITC，anti?CD4?Cy5、anti?CRTH2?PE和anti?FasL?FITC，anti?CD8?Cy5、anti?CRTH2?PE和anti?Fas?FITC，anti?CD8?Cy5、anti?CRTH2?PE和anti?FasL?FITC，以上各管配备相应的对照管。混匀。4℃避光30min，PBS洗涤2次，各管加入0.5ml缓冲液，上流式细胞仪检测。
1.3.3 外周血小板Fas、FasL测定
取3支试管，各加入100μl血小板悬液，分别加入小鼠抗人IgG1? FITC、anti?Fas?FITC和anti?FasL?FITC，混匀。4℃避光30min，PBS洗涤2次，各管加入0.5ml缓冲液，上流式细胞仪检测。
1.4 统计学分析
所有数据以±s表示，两两比较采用成组t检验，经SAS8.22软件分析。
2 结 果
2.1 外周血T细胞亚群的变化
ITP患者外周血Th、Th1、Th2细胞百分率较正常对照组均明显下降(P<0.05)，Tc、Tc1、Tc2细胞百分率均无明显变化(P>0.05)。(表1)
2.2 外周血T细胞亚群Fas、FasL检测结果
Th、Th1、Th2及Tc、Tc1、Tc2细胞Fas、FasL表达较正常对照组均明显升高(P<0.05)。(表2，3)
2.3 外周血血小板Fas、FasL检测结果
ITP患者血小板Fas的表达明显升高(P<0.01)，而FasL的表达较正常对照组无明显变化(P>0.05)。(表4)表1 两组外周血T细胞亚群百分率比较与正常对照组比较,*P<0.05表3 两组外周血T细胞亚群FasL表达百分率比较与正常对照组比较,*P<0.05表4 两组外周血血小板Fas、FasL表达百分率比较
3 讨 论
Fas(CD95)又称Apo?1，是一种分子量约48KD的Ⅰ型跨膜糖蛋白，Fas主要在外周CD4+，CD8+T细胞、B细胞，少量NK细胞，骨髓细胞及部分组织细胞，血小板等上表达。FasL又称为死亡配体，是TNF家族成员，其受体分子为Fas。FasL(CD95L)是一种分子量约40KD的Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要在被激活的T细胞和B细胞上表达。介导细胞凋亡途径有Fas/FasL途径、TNFR/TNF途径、P53途径、糖皮质激素系统等，而以Fas/FasL途径介导的细胞凋亡紊乱是体液和细胞免疫失调的主要原因[6]。Fas和FasL参与免疫应答过程中淋巴细胞数量的调控，与外周血激活的淋巴细胞凋亡过程有关。激活的淋巴细胞开始表达FasL，同时Fas表达增加，当Fas与细胞表面的FasL结合后可使激活的淋巴细胞在发挥免疫效应后立即通过细胞凋亡而清除，从而避免自身免疫性疾病的发生。如果Fas/FasL途径介导的淋巴细胞调亡发生障碍，则有可能诱发自身免疫性疾病的发生。目前认为ITP患者可能存在激活的淋巴细胞增加，激活淋巴细胞(Tc、NK细胞)的直接杀伤作用和诱导血小板凋亡，导致血小板破坏。Yoshimura等[7]发现Fas/FasL途径与ITP的发病密切相关，但有关Fas、FasL在ITP患儿T细胞亚群中表达目前未见报道。
Th细胞可以分为Th1、Th2和Th0细胞。Th1/Th2细胞之间的平衡，是体内体液免疫及细胞免疫间重要的调节枢纽[8]。Th1细胞主要分泌IL?2、IFN?γ和LT等细胞因子，主要介导迟发型超敏反应(DTH)和巨噬细胞活化等细胞免疫反应;Th2主要分泌IL?4、IL?5、IL?10和IL?13等细胞因子，促进B细胞增殖并分化成浆细胞，分泌特异性抗体，提高黏膜免疫力，介导体液免疫和Ⅰ型超敏反应。近年来，研究发现CD8+T至少可分为两群，一群与Th1相似，分泌IL?2、IFN?γ等细胞因子;另一群与Th2相似分泌IL?4、IL?5、IL?10等细胞因子[9]。人们将Th1和Tc1、Th2和Tc2分别统称为Th1类、Th2类细胞[10]。Th细胞之间的失衡与许多疾病的发生、密切相关，建立一种准确、灵敏、快速的检测Th的方法是研究Th细胞失衡与疾病关系的前提。虽然检测Th1/Th2的方法有多种，但其基本原理都是外周血淋巴细胞经刺激后，检测培养液中细胞因子的含量，或者检测细胞内细胞因子mRNA的表达，它们都无法判断所分泌的细胞因子是来自CD4+T细胞或是其他单个核细胞，所以并不能真正地检测出Th细胞的极化状态。Cosmi等[4]研究发现CRTH2是检测人Th2和Tc2最为可靠的表面标志，CRTH2是一种新的G蛋白偶联受体，与C5a受体和FMLP受体高度同源，IL?4能够上调其表达，而IFN?γ则下调其表达。CRTH2同时也是前列腺素D2的一种受体，参与白细胞的迁移，可能与炎症反应。他们认为尽管不是所有的CRTH2+T细胞产生Th2型的细胞因子，然而，CRTH2+T细胞仅包括Th2或Tc2细胞，而不包括Th0或Tc0细胞，亦不包括Th1或Tc1细胞。Tsuda等[11]的实验也表明CRTH2表达于Th2和Tc2表面，而不表达于Th1或Tc1表面。
ITP是由于循环血中抗血小板抗体增多导致血小板破坏增加而引起的常见出血性、自身免疫性疾病。近年来研究发现ITP患者外周血激活的淋巴细胞增多、细胞凋亡不足与疾病的发生有关[3]。我们采用流式细胞术检测了ITP患者T细胞亚群及其Fas和FasL蛋白的表达，发现ITP患者Th类细胞百分率均显著降低，而Tc类细胞百分率均无明显变化;T细胞各亚群Fas、FasL表达均显著升高。FasL主要在被激活的T细胞和B细胞上表达，是T细胞被激活的一种标志，FasL能诱导Fas阳性细胞的调亡。我们的结果提示：①ITP患者外周血T细胞凋亡不足，而不是T细胞整体凋亡不足，因为T细胞整体上看是降低的;②高表达的Fas、FasL可能参与了Th类各亚群的凋亡，而对Tc类各亚群影响不大。Fas/FasL系统是介导细胞凋亡的主要途径，不同的T细胞亚群对其敏感性不一致，可能是有多种正性或负性因子影响了Fas/FasL介导的细胞凋亡作用，如张哲等发现Fas和FasL的表达率与MDS CD34+细胞凋亡率无相关性，Bcl?2的表达与MDS CN34+细胞凋亡率呈负相关。Bcl?2是重要的凋亡抑制蛋白，可能与Fas/FasL系统有相反的作用。同时，我们还用流式细胞术检测了ITP患者血小板Fas、FasL的表达，结果显示ITP患者血小板Fas的表达显著升高，而FasL的表达无明显变化。与高清平等[8]报道的Fas、FasL均升高不完全一致，其原因可能与检测方法不同和患者个体差异有关。高表达Fas的血小板可与激活的T细胞上FasL结合，T细胞可通过Fas/FasL途径直接介导血小板凋亡。
本研究表明，Fas、FasL表达异常在ITP患者免疫功能紊乱、T细胞亚群及血小板凋亡中起重要作用，Fas/FasL系统可能与ITP免疫病理机制有关。进一步研究Fas/FasL系统对细胞凋亡的调控作用，将有助于指导包括ITP在内的免疫性疾病的。
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