海马神经元谷氨酸损伤研究
【摘要】 目的：本研究通过观察体外培养的大鼠胚胎海马神经元在谷氨酸损伤后，细胞活力变化及细胞损伤的方式，初步探讨谷氨酸对神经元的损伤机制。方法：通过MTT，观察不同浓度(62.5 μM、125 μM、250 μM、500 μM)的谷氨酸损伤后不同时间（6 h、12 h、18 h、24 h)海马神经元活力的变化。经相差显微镜观察谷氨酸对海马神经元胞体及突起的影响。通过TUNEL、Hoechst染色比较正常培养组和损伤组的凋亡率，分析谷氨酸对海马神经元的损伤作用。结果：MTT结果显示，谷氨酸对体外培养的胎鼠海马神经元有兴奋毒性，在所观察的剂量范围内，随着谷氨酸浓度的增加，作用逐步增强，至500 μM达峰值，随着损伤后孵育时间的延长，海马神经元活力逐渐下降。TUNEL和Hoechst染色结果也显示，125 μM谷氨酸对体外培养的胎鼠海马神经元有兴奋毒性，主要引起海马神经元的凋亡。结论：谷氨酸对体外培养的胎鼠海马神经元有兴奋毒性,且这种作用呈现剂量相关性。中等剂量（125 μM）谷氨酸损伤主要引起海马神经元的凋亡。
【关键词】 谷氨酸 海马神经元 TUNEL
[Abstract] Objective: To investigate the changes of cell vitality in cultured hippocampal neurons after glutamate stimulation, and the cellular mechanisms involved in neurotoxicity. Methods: Different concentrations of glutamate (62.5 μM, 125 μM, 250 μM, 500 μM) were applied to the cultured rat embryonic hippocampal neurons. Methyl-thiazole-tetrazolium (MTT) assay was used to detect the neuronal vitality after incubation different periods (6 h, 12 h, 18 h, 24 h). After glutamate was applied to the cells, phase contrast microscope, TUNEL and Hoechst assay were used to identify the glutamate-induced neurotoxicity. Results: The results of MTT indicated that glutamate could evoke neurotoxicity to the cultured hippocampal neurons, and when the concentrations of glutamate and the incubation time increased, the neurotoxicity augmented. Morphological observation, TUNEL and Hoechst revealed that glutamate induced hippocampal cell death in a prevailing form of apoptosis. Conclusion: Glutamate have obviously neurotoxicity in cultured 7～8 days hippocompal neurons in a dose-effect character, with apoptosis predominating after exposure to medium concentrations of glutamate in a delayed time course.
[Key words] Glutamate; Hippocampal neurons; Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick-end-labeling
脑卒中以高死亡率和高致残率严重威胁着人类的健康和社会劳动能力。在脑缺血过程中，各种神经递质发生一系列变化，如脑内氨基酸类神经递质大量增加，特别是缺血中心区域。兴奋性氨基酸如谷氨酸(glutamate, Glu)和天冬氨酸(aspartic, Asp )的过量释放是缺血性脑损伤的重要病理机制。据报道谷氨酸受体拮抗剂对脑缺血损伤有很好的保护作用[1]。同样，抑制性氨基酸对脑缺血有保护作用，可拮抗兴奋性氨基酸的毒性[2]。很多学者认为，兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸的平衡失调是缺血性脑损伤的原因之一[3]。
海马是边缘系统的重要组成部分，在学习、记忆、情绪反应及植物性神经功能等方面有重要作用，是老年性痴呆、癫痫等疾病的主要病灶之一，在结构上具有高度序化板层结构和神经元相对独立分布等特点。海马是神经元高度集中的部位，锥体神经元是海马区的主要成分，体外培养的海马神经元，对许多致病因素和化学损害较为敏感，因此在研究神经系统疾病的病理机制及方法中均以海马作为病理模型，如缺血/缺氧、癫痫、衰老和兴奋性毒素等均可引海马的特异性损害。在脑缺血模型中，海马神经元最早出现较严重的损害，并且海马缺血性损害和兴奋性神经毒有关，这可能和海马神经元含有高密度的谷氨酸能受体有关[4]。
本研究采用胎鼠海马神经元的无血清体外培养，获得高纯度的神经元。通过高分子量神经丝蛋白（neurofilament high molecular weight，NF-H）和神经胶质酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）染色，鉴定海马神经元的纯度；通过相差显微镜观察谷氨酸对海马神经元胞体及突起的影响；通过MTT检测在不同浓度谷氨酸损伤后，不同时间海马神经元存活率；同时通过TUNEL（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling），Hoe-chst比较损伤组和正常培养组凋亡率，探讨谷氨酸对海马神经元的损伤机制，为筛选抗谷氨酸兴奋毒性药物提供实验模型。
1 材料和方法
1.1 材料 动物：采用健康孕18～19天Sprague-Dawley (SD)大鼠，由南通大学实验动物中心提供；抗体：抗GFAP、NF-H抗体购自Sigma公司；其他试剂和材料：Neuronbasal培养基、B27、DMEM培养基购自Gibco公司，胰蛋白酶、Hoechst33342购自Sigma公司，TUNEL试剂盒购自Promega公司。
1.2 方法
1.2.1 海马神经元的原代培养[5] 孕18～19天SD大鼠复合麻醉剂麻醉，无菌条件下取胎鼠脑，置于解剖液中，解剖显微镜下仔细去除脑膜，取出双侧海马，于0.125%的胰酶37 ℃消化10 min，用完全培养基（90%DMEM+10%FBS）终止消化，制成单细胞悬液，调整细胞密度大约为106/ml，接种于事先用多聚赖氨酸包被的24孔/96孔细胞培养板。4 h后换成无血清的神经元培养基（98％ neurobasal medium＋2％B27）置5%CO2、饱和湿度、37 ℃培养箱培养7～8天。3天半换液。
1.2.2 免疫细胞化学 海马神经元按上法培养7天后，吸去培养液，用PBS洗涤一次，加入4%多聚甲醛500 μl，室温下固定30 min，去除固定液，用PBS室温下洗涤10 min×3次。用含10%羊血清、0.3% Triton X-100 的PBS液在37℃条件下封闭60 min，吸去封闭液。滴加一抗（rabbit anti-NF-H polyclonal antibody，1∶200，rabbit anti-GFAP polyclonal antibody，1∶300），4℃放置过夜，PBS洗。滴加二抗（FITC goat anti-rabbit IgG，1∶200），室温、避光放置2 h，PBS洗。以Hoechst（5 μg/ml）标记细胞核，PBS洗。实验中设不加一抗的空白对照组，除以PBS代替rabbit anti-NF-H polyclonal antibody，其余步骤同上。在激光共聚焦显微镜下观察免疫荧光细胞化学检测结果。随机计数500个细胞，NF-H阳性细胞百分率。Hoechst 33342染色检测细胞凋亡时，用4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS洗细胞两遍，各组加入Hoechst 33342染液（5 μg/ml）室温染色10 min，在倒置荧光显微镜下观察各组凋亡细胞数。每组设3个复孔，每孔随机取五个视野，实验重复3次。
1.2.3 海马神经元谷氨酸损伤处理[6] 海马神经元按上法培养7～8天后，吸出原来的培养基，用Locke's液洗涤细胞3次，每次5 min。 以Locke's液配制125 μM谷氨酸，其中添加1 μM甘氨酸。正常对照组（Locke's不含有125 μM谷氨酸）和实验组均作用15 min，撤除，再用Locke's液洗涤细胞3次，每次5 min。重新加入原来的培养基，继续培养。
1.2.4 MTT检测 海马神经元以1×106个/ml接种细胞于96孔培养板中，每孔0.1 ml。5%CO2培养箱中培养7～8天。加入谷氨酸损伤，分别于损伤后12 h、18 h、24 h。每孔加 10 μl MTT（5 mg/ml）放入37 ℃，5% CO2培养箱中培养4 h。然后每孔加入100 μl 20% SDS ，培养箱中培养20 h。酶标仪上570 nm(波长490 nm)处测定OD值。每个实验组设8个复孔，实验重复3次。
1.2.5 TUNEL法检测细胞凋亡[7] 海马神经元在24孔板上按上法培养7～8天。实验分2个实验组进行，损伤组用125 μM谷氨酸按上述损伤方法处理。谷氨酸处理后18 h吸去培养液，用4%多聚甲醛固定细胞30 min，室温下用新鲜PBS洗细胞两遍。再用0.2%Triton X-100通透细胞5 min。每孔加入100 μl Equilibrate Buffer，室温下作用5～10 min。然后每孔加入45 μl Equilibrate Buffer，1 μl rTDT，5 μl dNTP，1 μl rTDT酶，避光，37 ℃孵育60 min。加入2×SSC作用15分钟，终止反应。并且在室温下，用新鲜PBS 。最后加入0.5 μg/ml PI染液，染色10 min。用纯水洗。采用共聚焦显微镜观察，计数。每组设3个复孔，每孔随机取5个视野，实验重复3次。
2 结 果
2.1 海马神经元的培养 倒置显微镜下观察，海马神经元分离培养不久后即贴壁，胞体表面光洁，呈锥形或椭圆形，有均匀一致的反光，且折光性明显（图1A，B）。
2.2 免疫荧光细胞化学染色 用无血清的神经元培养基（98％ neurobasal medium＋2％B27）培养7～8天，免疫荧光细胞化学染色可以看到NF-H阳性细胞占绝大多数，GFAP阳性占2.17%，培养的海马神经元纯度达95.4%以上。可以用于后续实验。结果见图2。
2.3 不同浓度谷氨酸对海马神经元的兴奋性毒性 海马神经元培养7～8天后，用不同浓度的谷氨酸损伤神经元，24 h后采用MTT法观察各组细胞活力，结果显示：与正常对照组相比，随着谷氨酸浓度的增加，海马神经元活力显著下降，呈剂量依赖性(图3A)（P均<0.05）。加入125 μM谷氨酸损伤神经元，分别在损伤后6 h、12 h、8 h、24 h后采用MTT，观察各组细胞活力，结果表明，随着损伤时间的延长，海马神经元活力逐渐下降(图3B)。
2.4 125 μM谷氨酸损伤海马神经元后细胞形态学变化 倒置显微镜下观察，正常海马神经元胞体表面光洁，突起长而折光性明显，突起交织成网状（图4A）。谷氨酸对原代培养7～8天的海马神经元有明显细胞毒性，海马神经元暴露于125 μM谷氨酸15 min，18 h后可见部分细胞变圆，胞体肿胀，细胞失去原有形态，突起淡化、减少或消失，细胞内、外出现较多的黑色颗粒，部分细胞凋亡，贴壁不牢，折光性下降（图4B）。
2.5 Hoechst 33342染色检测细胞凋亡 见图5。倒置显微镜下观察，谷氨酸对原代培养7～8天的海马神经元有明显细胞毒性，海马神经元暴露于125 μM谷氨酸，18 h后Hoechst 33342染色可见部分细胞呈现出典型的凋亡细胞的细胞核形态特征，细胞核明显变小，部分染色质出现浓缩状态，进一步高度凝聚，细胞核碎裂成四、五个凋亡小体，而正常培养的海马神经元细胞的胞核染色后，可清晰地看到细胞核为圆形，发出均匀的蓝色荧光，随机选取10个视野，每个视野细胞计数不少于100个，对凋亡细胞的比率进行。结果表明18 h后凋亡细胞为（47.73±4.86）%。
2.6 TUNEL检测细胞凋亡 激光共聚焦显微镜观察可看到正常细胞胞核被染成红色，胞核大而完整（图6A），用125 μM谷氨酸损伤可导致神经元凋亡，凋亡细胞胞核变小，并且胞核碎裂成众多凋亡小体而且既有红色荧光，又有绿色荧光（图6B、C）。在神经元培养基中混杂的胶质细胞逐渐凋亡，体外培养7～8天后，凋亡约有(8.68±3.65)%，主要是各种胶质细胞；用125 μM谷氨酸损伤后，凋亡细胞逐渐增多，18 h后约有(39.8±1.71)%的细胞凋亡，主要是各种神经细胞。
3 讨 论
谷氨酸是脑内含量丰富的兴奋性氨基酸，兼有对神经元的兴奋作用和神经毒作用。目前，有许多实验表明，脑缺血初期，细胞外液可持续高出正常值的数十倍[8]，构成Glu的毒性环境，并且缺血缺氧过程中，Glu大量释放是灭活机制-摄取功能发生障碍的直接后果。
细胞的凋亡检测现在已有多种方法，这些方法分别针对凋亡细胞不同阶段的特征性改变进行检测，其中细胞核的荧光染色是目前比较可靠的方法，因为核固缩与核碎裂是凋亡细胞的一种广谱性特征。TUNEL能对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，在本实验中，我们判断细胞凋亡的依据主要是TUNEL染色、凋亡细胞的核形态的变化，同时结合显微镜下细胞的形态。
谷氨酸兴奋毒性引起的损伤形式及程度很大程度上取决于细胞的类型、作用的时间和浓度，以往的研究也表明谷氨酸兴奋毒性能引起神经元凋亡，但谷氨酸刺激浓度和时间差异比较大[6,7,9]。
本研究发现适当中等浓度（125 μM）谷氨酸刺激短时间后神经元损伤主要以凋亡为主，在损伤24小时内细胞存活率随时间延长而降低。谷氨酸损伤18小时后，细胞明显表现出胞体缩小、胞内颗粒物增加等部分凋亡特征，Hoechst染色可观察到核分裂成众多凋亡小体。
体内的缺血研究也表明存在凋亡和坏死两种细胞损伤形式。实际上不论在体内还是体外，细胞对于同一种刺激的反应既可以是坏死也可以是凋亡，这取决于刺激的强度和持续时间，中等强度的损伤往往会激活细胞内的凋亡因子，启动细胞凋亡的级联反应，并且这是一个主动的、耗能的过程，需要ATP的存在。而强烈的损伤会很快使细胞崩解，在凋亡系统启动之前细胞已经坏死[10]。在本研究中，中等浓度谷氨酸刺激引起了明显的凋亡。
本实验筛选出一个比较适当的谷氨酸浓度，为筛选抗谷氨酸兴奋毒性的药物和临床缺血缺氧性脑病的提供了帮助。
【】
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