原发性肝癌外周血白蛋白基因片段扩增的临床意义

          作者：朱云松，杨大明，姚登福，孟宪镛，李玉明，钱俊波，王亚明，许利华

【摘要】  　　目的:探讨外周血白蛋白(Alb)基因在肝癌早期诊断和鉴别诊断中的临床价值。方法:以巢式聚合酶链反应(RT-PCR)扩增外周血中Alb的基因片段分析在原发性肝癌（HCC）、慢性肝病和非肝病患者外周血中血白蛋白基因表达。结果: 67例肝癌患者外周血中Alb基因的检出率为59.7%,明显高于肝硬化、慢性肝炎和肝外肿瘤组患者（P<0.01),但与急性肝炎组无明显差别（P>0.05);在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期肝癌中, Alb基因片段阳性率分别为33.3%、36.8%和76.9%;肝内有无转移的肝癌组间存在明显差异（P<0.05),尤其在伴有肝外远处转移的肝癌中, Alb基因全数阳性(100.0%)。结论:分析外周血中Alb基因有助于肝癌的诊断、肝癌远处转移判别的监测。

【关键词】  原发性肝癌 Alb基因 RT-巢式PCR

　　 [Abstract]   Objective: To explore clinical values of peripheral blood albumin gene in early diagnosis and differential diagnosis of hepatocellular carcinoma (HCC). Methods: The Alb gene was amplified by nested reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) in patients with hepatocellular carcinoma, chronic liver or non-liver disease. Results: The positive rate of peripheral blood Alb gene fragments from 67 patients with HCC was 59.7%. It was significantly higher than that from the patients with liver cirrhosis (LC), chronic hepatitis (CH) and extrahepatic tumor (ET) （P<0.01), but there is no significant difference in positive rates of Alb-mRNA between HCC and acute hepatitis (AH). The Alb-mRNA was correlated with the stage of HCC and the presence of intrahepatic metastasis. The expression of Alb gene was 33.3% in I stage HCC, 36.8% in Ⅱ stage HCC and 76.9% in Ⅲ stage HCC. It was positive in all patients with extrahepatic metastasis(100%). Conclusion: The analysis of peripheral blood Alb gene is useful for diagnosis and differentiation of HCC and judgment extrahepatic metastasis.

　　 [Key words]   Hepatocellular carcinoma；Albumin gene；Nested reverse transcription polymerase chain reaction

　　原发性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是临床最常见、最难的恶性肿瘤,HCC切除和肝移植是治疗的最佳选择,但绝大多数患者在术后发生移植肝或远处复发,其原因是在术前未能检出微转移灶或术中肝癌细胞释放入血所致,因而如能早期准确地检出外周血或淋巴结转移灶,才能设法降低复发率提高生存率[1，2]。本研究以RT-巢式PCR方法分析肝病患者外周血中Alb-mRNA,以观察它们在肝癌诊断、肝癌远处转移判断的临床价值。

　　1   材料与方法

　　1.1   研究对象   门诊和住院患者中收集急性肝炎12例、慢性肝炎20例、肝硬化16例、肝癌67例（男61例，女6例，年龄25~81岁，平均49.8±11.4岁）和非肝肿瘤14例（肺癌和胃癌各5例，食管癌、胰腺癌、结肠癌和胆管癌各1例）。肝癌和肝炎的诊断分别按照全国肝癌防治协作组标准和1995年北京全国肝炎会议制定标准核实诊断。另从健康正常人中收集外周血标本20份作为对照。所有标本于清晨空腹采血5 ml，以肝素抗凝并及时存于4 ℃保存，作外周血有核细胞制备。所有研究对象均以放射免疫分析法检测血AFP浓度。

　　1.2   外周血有核细胞分离及总RNA制备   肝素抗凝血在2小时内以淋巴细胞分离液及密度梯度离心法分离外周血有核细胞。经生理盐水洗涤两次后进行有核细胞计数。置于无RNAase的匀浆器中,加入TRIzol 1.0 ml匀浆2分钟,提取总RNA,最后加入TE缓冲液100 μl，取部分RNA于UV-2201型紫外分光光度计上测A260，换算出总RNA浓度。经紫外分光扫描鉴定,已纯化的RNA未受到污染或降解，其余RNA置于-85 ℃保存备用。

　　1.3   巢式PCR引物设计   参照报道的人类白蛋白核苷酸序列,自行设计巢式PCR扩增引物，由院上海细胞研究所合成。设计扩增序列位于人类白蛋白基因的1385-1806号核苷酸序列之间。Alb外部引物：Alb-1  5'-AGAAAGTACCCCAAGTGTCAA-3'(nt，1385-1405), Alb-2  5'-AGCTGCGAAATCATCCATAAC-3'(nt,1786-1806);内部引物：Alb-3 5'-GTGTCAACTCCAACTCTTGTA-3'(nt,1398-1419），Alb-4 5'-TCAAGATTTGTCTCTCCTTCT-3' (nt，1699-1720)。

　　1.4   逆转录巢式PCR扩增方法   肝细胞中总RNA先经随机引物(Promega)和逆转录酶(Gibco/BRL)合成Alb-cDNA，逆转录反应程序为：23 ℃，10分钟；42 ℃，60分钟；95 ℃，10分钟。逆转录结束后在PE480型DNA扩增仪上行巢式PCR扩增,PCR循环程序为:93 ℃，30秒；55 ℃，30秒；72 ℃，1分钟连续35个循环结束后,在72 ℃10分钟后于4 ℃保存。第一阶段PCR以外部引物(Alb-1,Alb-2)和cDNA为模板,扩增产物为422 bp；第二阶段PCR，以已扩增第一次PCR产物为模板和内部引物（Alb-3,Alb-4）进行扩增,最终PCR产物323 bp。

　　1.5   统计学方法   计量资料以x±s表示进行F检验，两两比较用q检验，计数资料用χ2检验，以P<0.05表示组间差异具有统计学意义。

　　2   结      果

　　2.1   外周血Alb基因扩增法灵敏度   以RT-巢式PCR法，对67例HCC外周血标本中有核细胞进行分离，分别应用了RT-PCR(一阶段)和RT-巢式PCR(二阶段)对其mRNA进行扩增分析。结果如图RT-PCR检出Alb基因的阳性率分别为5.9%(4/67)；RT-巢式PCR对两者的检出阳性率分别为59.7%(40/67)，可见2种方法的扩增阳性率间存在非常明显的差异（P<0.05)。外周血中Alb基因的扩增区带，主要见于肝癌患者和急性肝炎患者。区带清晰未见非特异性扩增区带出现（见图2）。按肝癌组织中总RNA浓度为5 μg/μl标本,分别稀释102、103、104、105、106、107和108倍，以RT-巢式PCR进行扩增分析，可见在总RNA浓度为5 pg/μl以上时均可出现阳性。

　　2.2   肝病患者外周血中Alb基因的扩增分析   分别对肝病、肝外肿瘤和正常对照标本的外周血有核细胞中的Alb-mRNA进行了扩增分析(表1)。Alb基因片段的检出率在肝癌组为59.7%，明显高于除急性肝炎组外的其他各组。

　　2.3   Alb基因检出率与肝癌临床分期   在所分析肝癌患者中,对肝癌的临床分期、是否伴有肝内或肝外转移进行分组比较，其结果见表2。Alb基因片段阳性率，在Ⅰ期和Ⅱ期两肝癌组中未见明显差异,但在临床Ⅲ期肝癌患者中，Alb基因的检出率为76.9%(30/39)，显著高于Ⅰ期和Ⅱ期肝癌的检出率（P<0.05)。在伴有肝内转移组阳性率为71.4%（25/35）显著高于不伴有肝内转移组15%（15/32）（P<0.05)，尤其在肝外转移的所测4例肝癌中，基因标志均100%出现阳性区带。

　　2.4   Alb基因与肝癌大小的关系   在67例肝癌中按其瘤体大小分为两组:瘤体≤3 cm有9例，Alb基因片段阳性3例(33.3%)；瘤体＞3 cm有58例, Alb基因片段的检出率63.8%(37/58)，差异无统计学意义（P>0.05）。

　　3   讨      论

　　目前认为手术是肝癌有效手段,但是由于部分肝癌患者术前血循环中已存在少量癌细胞,在机体免疫机能遭受破坏情况下,血中癌细胞得以增殖,仍有50%~70%的患者在术后发生移植肝或远处复发，复发率高，甚至小肝癌亦如此。因此识别血循环中有无癌细胞,观察癌细胞动态变化,对指导临床治疗和判断预后具有重要意义。人类AFP基因和Alb基因串联排列于第4号染色体的长臂上; Alb基因由14个外显子组成, Alb启动子位于AFP增强子上游28 kb；AFP增强子作用是从AFP起动子转变到白蛋白启动子,两者表达调控存在密切关系。实验证实大鼠胚胎时期两基因均有较高表达，但出生后AFP表达迅速降低直至关闭；而Alb基因表达呈稳定升高。国内外多项研究表明外周血AFP-mRNA的变化与肝癌的转移及术后复发密切相关，是判断肝癌患者预后的重要指标之一。而患者外周血中检测出Alb-mRNA能否作为判断循环中有无癌细胞特异性标志物,尚有争议[2，3]。

　　本研究结果显示肝癌组Alb-mRNA阳性率59.7%(40/67),而肝硬化组和慢性肝炎组阳性率仅为25.0%(4/16)和20.0%(1/5)，肝外肿瘤和健康人群未发现1例阳性。同时，我们也注意到在急性肝炎组12例患者中有8例Alb-mRNA阳性（66.7%）。除了急性肝炎组外,其它各组阳性率与HCC组比较，差别有显著性。随着临床分期不同，其中Ⅲ期HCC明显高于Ⅰ、Ⅱ期，差异均有统计学意义。4例有远处转移者中2例椎骨转移,1例肺转移,1例腹腔淋巴结转移, Alb-mRNA均阳性(100%)。结果表明Alb-mRNA阳性率与疾病严重程度有关,晚期伴有肝内转移者明显高于早期不伴有肝内转移者，提示在肝细胞发生癌变时,肝细胞表达Alb也随之发生改变，Alb-mRNA与肝癌转移和复发可能有一定关系。肝细胞癌变和转移是一个极其复杂的过程,有多种因素参与；大量实验证实，肝癌组织中血管内皮生长因子(VEGF)-mRNA表达和血浆VEGF均明显升高,VEGF能够促进肝癌组织血管生成,增加血管通透性,使得肿瘤细胞或正常肝细胞更易脱落进入血循环[2]。半定量RT-PCR分析也证实肝癌患者外周血Alb-mRNA含量高于对照组。进一步研究发现,在肿癌直径≤3 cm与>3 cm的两组HCC患者中，外周血Alb -mRNA阳性率无显著性差别（P>0.05)；提示其阳性率与肿瘤大小无关,即使小肝癌也可能存在血行播散,发生微小转移灶。由于白蛋白为肝细胞表达和分泌,白蛋白基因被认为是肝细胞一种特异性标志物。不排除在非HCC患者外周血中检测出Alb-mRNA, 其有可能来自正常肝细胞脱落入血循环[3~5]。急性肝炎时,Alb-mRNA阳性率增高可能由于急性炎症期间，一些肝细胞被释放到周围血中,也可能因肝细胞再生过程中,一些增生的肝细胞进入血循环。由于急性肝炎的临床特点及辅助检查结果均与肝癌有迥异，故不难与肝癌相鉴别。因此我们认为，检测外周血Alb-mRNA对诊断HCC和判断有无转移,仍不失为行之有效的方法之一。

【】
  [1] Cheung ST, Fan ST, Lee YT, et al. Albumin mRNA in plasma predicts post-transplant recurrence of patients with hepatocellular carcinoma[J]. Transplantation，2008，85(1):81-87.

[2] Yao DF, Dong ZZ, Yao M.Specific molecular markers in hepatocellular carcinoma[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int， 2007，6(3):241-247.

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