舒林酸对卵巢癌SKOV3细胞作用的初步研究

                    作者：苏丽，孙晓雷，王春，贲志云，苏敏

【摘要】  　　目的：研究舒林酸对卵巢癌SKOV3细胞的生长和细胞运动的影响以及对基质金属蛋白酶2（MMP2）、环氧合酶-2(COX-2)表达的影响：方法：将不同浓度的舒林酸加入培养液中观察其对SKOV3细胞形态的影响，采用MTT法观察舒林酸对SKOV3细胞生长的影响，通过划痕试验观察舒林酸对SKOV3细胞运动的影响，利用免疫细胞化学方法研究舒林酸对SKOV3细胞MMP2、COX-2表达的影响。结果：舒林酸与SKOV3细胞体外培养可使肿瘤细胞伪足回缩、细胞变圆，MTT试验提示舒林酸可抑制卵巢癌SKOV3细胞的生长，划痕试验提示舒林酸可抑制SKOV3细胞的运动，免疫细胞化学实验提示舒林酸显著抑制SKOV3细胞MMP2、COX-2的表达，有时间和剂量依赖效应。结论：舒林酸可能通过抑制MMP2、COX-2的表达而抑制卵巢癌SKOV3细胞的生长和运动。

【关键词】  卵巢癌 舒林酸 基质金属蛋白酶2 环氧合酶-2

　　[Abstracts]   Objective: To investigate the effects of sulindac on the growth and motility of ovarian cancer cell SKOV3 and its involved mechanism. Methods: In order to detect the effects of sulindac on cultured SKOV3, sulindac with different concentration and untreated control were set up. The changes in morphology of SKOV3 were observed by phase contrast microscopy. MTT colorimetric assay was used to study the effects of sulindac on SKOV3 cell growth. Motility of SKOV3 was determined by scarification assay. The effects of sulindac on expression of MMP2 and COX-2 were detected by immunohistochemistry. Results: Sulindac could make SKOV3 become round and inhibit its growth and motility. Expressions of matrix metalloproteinase 2(MMP2) and cyclooxygenase-2(COX-2) in SKOV3 were inhibited by sulindac in a dose- and time-dependent pattern. Conclusions: Sulindac can inhibit growth and motility of SKOV3, and the mechanism may be related to the down-regulation of MMP2 and COX-2 expressions．

　　[Key words]   Ovarian carcinoma; Sulindac; Matrix metalloproteinase 2; Cyclooxygenase-2

　　舒林酸属于非甾体抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory drugs , NSAIDs) ,是临床上常用合成的抗炎镇痛药。大量的流行病学资料提示长期服用NSAIDs可以降低卵巢癌[1，2]、乳腺癌、前列腺癌、肠癌、胃癌[3]、肺癌等[4]多种肿瘤的发生。但对于卵巢浆液性囊腺癌方面的研究较少，其作用机制也不清楚。本研究旨在探讨舒林酸对卵巢浆液性囊腺癌SKOV3细胞生长和细胞运动的关系及其对SKOV3细胞表达基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、环氧化酶（cyclooxygenase-2,COX-2）的影响。

　　1   材料与方法

　　1.1   细胞和试剂   人卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKOV3和舒林酸由复旦大学附属妇产科丰有吉教授惠赠。RPMI1640细胞培养基购自Gibco公司，小牛血清购自四季青生物工程公司，ABC免疫组化试剂盒购自华美生物工程有限公司产品，鼠抗人MMP2、COX-2单克隆抗体为Cell Signaling产品。

　　1.2   试验方法

　　1.2.1   细胞接种培养与加药   将处于对数生长期的卵巢癌SKOV3细胞稀释为单细胞悬液，以含10％小牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度至2×106/ml，加入24孔培养板中，每孔2 ml，共12孔，待细胞贴壁后，加入不同浓度的以DMSO溶解的舒林酸，使每孔的舒林酸终浓度分别为100 μmol/L、200 μmol/L，每个浓度设4个复孔，另2孔加0.1％DMSO作为对照，不加药的2孔为阴性对照组。以2.8％的碳酸氢钠调节培养液pH，以排除舒林酸使培养液酸化可能对细胞生长产生影响。将细胞置于含5％CO2的培养箱中37 ℃分别培养24 h、48 h，用倒置相差显微镜观察。

　　1.2.2   MTT细胞增殖试验   以上每孔加入MTT 20 μl，培养4 h，弃上清液，每孔再加入DMSO 150 μl室温放置30 min，以酶标仪选择490 nm波长测定各孔平均光密度值（OD值）。

　　1.2.3   划痕试验   将SKOV3细胞接种于24孔板内培养，待细胞基本铺满，用tip头在培养板内纵向划痕，形成培养细胞缺损区域带，划痕后PBS洗2次，分别加入以DMSO溶解的100 μmol/L、200 μmol/L舒林酸继续培养，对照组加等体积0.1 ％DMSO，阴性对照组加PBS。孵育48 h后，倒置显微镜下观察划痕处细胞的覆盖情况。随机测量8点垂直于划痕方向的宽度，8点的均值作为实验的初始划痕宽度值。按公式计算细胞迁移速率=(初始划痕宽度值－相应点划痕宽度值)／初始划痕宽度值×100％。

　　1.2.4   免疫细胞化学检测   6孔培养板每孔置高压蒸汽灭菌的无菌盖玻片，将处于对数生长期的SKOV3细胞稀释为单细胞悬液，以含10％小牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度至2×106/ml ，每孔接种1 ml，待细胞贴壁生长至50％融合时，吸去培养液，每孔加2 ml新鲜RPMI1640完全培养液，再加10 μl以DMSO溶解的舒林酸，使其终浓度分别为100 μmol/L、200 μmol/L，并设DMSO对照孔和空白对照，在含5％CO2的培养箱中37 ℃培养24 h，取出培养板，弃培养液，PBS洗2次，95％乙醇固定30 min，冰箱保存，用于COX-2、MMP2免疫细胞化学染色。免疫组化采用ABC三步法，以PBS代替一抗作为阴性对照。鼠抗人COX-2、MMP2一抗的稀释度均为1∶100。免疫细胞化学检测结果图像分析采用IMS DNA/彩色图像分析综合系统，对图像进行扫描，采用单盲方式，每张切片随机选择10个200倍视野，得到阳性颗粒的强度均值（OD值）、阳性面积，计算强度均值×阳性面积。

　　1.3   统计学方法   采用Stata7.0软件进行统计分析，计量资料用x±s表示，采用方差分析，两两比较用q检验，P＜0.01示差异有统计学意义。

　　2   结      果

　　2.1   舒林酸对SKOV3细胞形态的影响   舒林酸加入SKOV3细胞培养24 h后，于细胞融合状态为50%左右时在倒置显微镜下观察活细胞形态，细胞形态无明显改变。加药48 h后，可见SKOV3细胞逐渐胞质突起减少、变短，细胞变圆，以舒林酸200 μmol/L浓度孔尤为显著，见图1A-C。DMSO组细胞形态无明显变化。

　　2.2   舒林酸对SKOV3细胞生长的影响   MTT法检测加舒林酸培养后的SKOV3细胞生长明显受到抑制，以用药48 h后舒林酸200 μmol/L浓度孔尤为显著（P<0.01），而0.1% DMSO组无明显影响，见表1。

　　2.3   舒林酸对SKOV3细胞迁移力的影响   SKOV3细胞加入舒林酸培养后，随着舒林酸浓度的增加，肿瘤细胞向划痕区的迁移速度减慢，48 h加PBS的SKOV3细胞划痕区明显变窄，细胞移动速率近100％。加舒林酸100 μmol/L组稍变窄，细胞移动速率为(45.6±4.18)％。而舒林酸200 μmol/L组细胞划痕区变窄相对不明显，细胞移动速率为(32.7±3.24)％，同时镜下可见部分细胞间隙增宽，见图1D-F。

　　2.4   舒林酸对SKOV3细胞MMP2、COX-2蛋白表达的影响   用免疫细胞化学方法检测SKOV3细胞中MMP2、 COX-2蛋白的表达，结果显示：COX-2和MMP2的阳性产物为棕黄色颗粒，表达在SKOV3细胞的胞质。在SKOV3细胞中的表达为中等强度。未处理的SKOV3细胞的MMP2表达的OD值（9.67±0.84）显著高于舒林酸100 μmol/L组（3.10±0.93）和舒林酸200 μmol/L组（1.37±0.62），未处理的SKOV3细胞的COX-2表达的OD值（6.93+0.47）显著高于舒林酸100 μmol/L组（2.67±0.23）和200 μmol/L组（1.07±0.36），见图1G-I，J-L。

　　3   讨      论

　　近年来研究表明，舒林酸能够抑制卵巢癌细胞的转移，与化疗药物联合应用对卵巢癌细胞有生长抑制作用。舒林酸在体内代谢为硫化物和砜化物，硫化代谢产物是其主要活性形式，舒林酸代谢产物能抑制人卵巢癌细胞SKOV3诱导的裸鼠腹腔内肿瘤和皮下移植瘤的生长，其作用机制可能与降低VEGF、MMP2[5]的表达，抑制肿瘤血管生成有关。舒林酸砜化物已用于临床，与细胞毒类药物相比，舒林酸对肾脏和胃肠道的毒性作用小，可长期服用，具有一定的应用前景。

　　本实验在倒置显微镜下观察，经舒林酸处理后的卵巢癌细胞SKOV3的伪足回缩，细胞变圆，悬浮，且有时间和剂量依赖效应，表明舒林酸对SKOV3细胞的生长有抑制作用。通过MTT比色法检测舒林酸对SKOV3细胞的增殖也有明显的抑制作用，且随着作用时间的延长和剂量的增大抑制作用越来越明显。舒林酸200 μmol/L对SKOV3细胞有显著的抑制效应。

　　基质金属蛋白酶(MMPs)是一组降解细胞外基质（ECM）的含锌蛋白酶类，在正常稳定状态组织中MMPs表达量很少，在炎症细胞因子等的刺激下和细胞转化过程中其表达量上升。侵袭与转移是卵巢上皮癌的重要特点，MMP2是卵巢癌发生浸润与转移的主要蛋白酶，其表达活性升高，可能是降解细胞外基质和开始转移的信号及重要途径。因此，以MMP2为靶点研究基质金属蛋白酶抑制剂(MMP inhibitors，MMPI)对卵巢肿瘤的影响成为热点[6]。

　　NSAIDs的作用靶点为COX，是催化花生四烯酸合成前列腺素(prostaglandin,PG)的关键酶。COX-2在有丝分裂原和炎症等刺激下产生，其持续表达则具有促肿瘤作用，COX-2及其产物前列腺素PGE2 参与肿瘤细胞增殖调控，并通过促进肿瘤组织VEGF表达，从而促进肿瘤的生长和转移。研究发现COX-2在许多癌前期病变组织和恶性肿瘤组织中过度表达，故成为肿瘤化学预防和的靶点[7]。近年来，体外实验发现COX-2抑制剂对多种卵巢癌细胞株如OVCAR-3、Caov-3有生长抑制作用，明显降低与细胞分裂相关的Ki-67蛋白的表达[8]。本实验发现COX-2在卵巢癌SKOV3细胞中呈中等强度的表达，舒林酸处理SKOV3细胞后可抑制COX-2的表达。

【】
  [1] Moysich KB, Mettlin C, Piver MS, et al. Regular use of analgesic drugs and ovarian cancer risk[J]. Cancer Epide-miol Biomarkers Prev，2001, 10（8）: 903-906.

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