唾液富组蛋白5表达载体的构建

【摘要】  目的 将唾液富组蛋白5 cDNA克隆至表达载体pGEX?4T?1。方法 EcoRⅠ+ SalⅠ双酶切克隆载体pMD19?T?hrp5及pGEX?4T?1，回收目的片段hrp5及双酶切载体pGEX?4T?1，将二者连接后转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选阳性菌落，PCR、酶切、测序鉴定重组质粒。结果 唾液富组蛋白5的cDNA正确克隆至表达载体pGEX?4T?1，无突变。 结论 重组载体pGEX?4T?1?hrp5构建成功。

【关键词】  唾液富组蛋白5 克隆 表达载体

    Construction of Expression Vector of Salivary Histatin 5

    ZHOU Qi，JIN Ke?hua，LUO De?sheng，et al

    (Students of Grade 2004, Xianning University Medical School，Xianning Hubei  437100，China)

    ABSTRACT：Objective To clone the cDNA of salivary histatin 5 to expression vector pGEX?4T?1.Methods pMD19?T?hrp5 and pGEX?4T?1 were digested by SalⅠ+ EcoR.The digested hrp5 and pGEX?4T?1 were linked and transformed to E.coli DH5α，and the positive colonies were screened by ampicillin, and identified by PCR，digestion and sequencing. Results The cDNA of hitatin 5 was correctly inserted into expression vector pGEX?4T?1 without mutation. Conclusion Recombinant vector pGEX?4T?1?hrp5 was constructed successfully.

    KEY WORDS:Salivavry Histatin 5；Clone；Expression vector

    唾液富组蛋白5（HRP5）为富含组氨酸的阳离子多肽，存在于人类和灵长类动物腮腺唾液分泌物中。研究表明HRP5能有效杀灭耐药的白色念珠菌，且具有抗细菌、抗肿瘤及关节炎的作用，作用机理独特，未发现毒副作用，不易诱导抗药菌株的产生，作为多肽类药物防治口腔等疾病潜力巨大[1]。唾液中HRP5含量低，采集唾液极为不便，提取过程繁琐，产率低；化学合成成本高；我们构建了含HRP5基因的原核表达载体，以望表达具有生物活性的HRP5。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    克隆载体pMD19?T?hrp5为前期构建[2]，原核表达载体pGEX?4T?1、大肠杆菌DH5α购自invitrogen公司，限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、质粒小提试剂盒、凝胶回收试剂盒、酶购自宝生物（大连）公司。氨苄青霉素（Amp）、琼脂糖、Yeast Extract、Tryptone、DNA Marker购自武汉凌飞科技公司，引物由上海英骏公司合成。

    1.2  提取质粒pGEX?4T?1

    将含pGEX?4T?1的菌株于含 Amp（100μg/ml）的固体LB培养基上划线，37℃倒置培养过夜。

    选择生长良好的单菌落，接种至4ml含Amp（100μg/ml）的LB培养基，37℃ 200转/min（rpm）振荡培养12h。

    取1.5 ml×2菌液，按试剂盒抽提质粒。

    1.3  目的片段的酶切和回收

    按[2]体系，酶切5份克隆载体，合并反应液，沉淀后进行2％琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段，按试剂盒回收。

    1.4  酶切表达载体并回收

    酶切体系如下：

    pGEX?4T?1 6μl

    10×H Buffer 6μl

    EcoRⅠ 2μl

    SalⅠ2μl

    dH2O 44μl

    温和混匀，37℃水浴4h；加入120μl无水乙醇，6μl 3mol/L 醋酸钠，混匀，-80℃沉淀1h；12000 rpm离心5min，弃乙醇，600μl 70％乙醇洗涤沉淀，12000 rpm离心5min，弃乙醇，室温风干，加入20μl dH2O溶解沉淀，0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，按试剂盒回收表达载体。

    1.5  表达载体构建

    取目的片段及酶切载体各4μl，10×ligation buffer 1μl，T4 DNA ligase 1μl，混匀，16℃连接过夜。转化DH5α感受细胞，于含Amp（100μg/ml）的LB培养基筛选阳性菌落。

    1.6  重组表达载体的鉴定

    1.6.1  PCR鉴定

    挑取阳性菌落，用鉴定引物P1: 5′GTGAATTCGACTCTCATGCG 3′,P2: 5′ATGTCGACATAACCGCGATG 3′ PCR鉴定，反应体系：dNTPs（10mmol/L）1μl，10×buffer 5μl， MgCl2（25mmol/L）3μl，P1(5pmol/L) 2μl，P2(5pmol/L) 2μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl) 0.25μl，ddH2O 36.5μl。循环参数：始变性 95℃ 3min；94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 30s 30个循环；72℃延伸10min。扩增后电泳检测。

    1.6.2  酶切鉴定

    培养PCR鉴定的阳性菌落，抽提质粒，酶切鉴定。酶切体系：

    pGEX?4T?1 20μl

    10×H Buffer 10μl

    EcoRⅠ 3μl

    SalⅠ3μl

    dH2O 64μl

    温和混匀，37℃水浴4h；按1.4方法沉淀、洗涤、溶解，2.0%琼脂糖凝胶鉴定。

    1.6.3  测序鉴定

    将1.6.2酶切鉴定的阳性质粒送宝生物（大连）公司进行DNA序列测定。

    2  结  果

    2.1  质粒pGEX?4T?1的提取

    电泳后可见1、2泳道抽提片段大小位于4367～6557bp，与质粒pGEX?4T?1（4900bp）相符，即为所需质粒（图1）。 

    2.2  重组表达载体的鉴定

    2.2.1  PCR鉴定

    由图2可知，重组质粒PCR产物略小于100bp，与目的片段（92 bp）长度相符。

    2.2.2   酶切鉴定

    酶切后鉴定结果如图3，重组载体双酶切（1、2泳道）后出现略小于100bp片段，与插入目的基因大小一致。

    2.2.3  重组载体序列测定

    将PCR、酶切鉴定的阳性重组载体送宝生物（大连）公司进行序列测定，结果表明，目的基因正确重组至表达载体pGEX?4T?1，无点突变、移码突变。

    图 1  质粒pGEX?4T?1的提取

    M：DNA  Marker；1～2：pGEX?4T?1

    图2  重组载体PCR鉴定

    M：DNA  Marker；1：PCR鉴定产物；2：阴性对照

    图 3  重组载体酶切鉴定

    M：DNA  Marker；1～2：

    重组载体 EcoR I+Bam H I双酶切

    3  讨  论

    HRP5是一种具有细菌毒性的蛋白，对大肠杆菌有一定杀伤作用，不宜选择组成性表达的原核载体。本实验选用的表达载体pGEX?4T?1在酶切位点的5′ 端带有编码谷胱甘肽巯基转移酶（GST）基因，将目的片段插入其下游，可与其融合表达。由于GST可干扰HRP5的空间结构的形成，屏蔽或降低HRP5对大肠杆菌的细胞毒作用，以利其在细胞中高效表达，同时利用GST与标记有谷胱甘肽的的凝胶进行亲和层析，便于融合蛋白表达后分离纯化。

    HRP5基因不足100bp，只占重组载体分子量的极小部分，酶切后电泳条带不明显，应增加酶切体系中重组载体量，保证有足量的酶切片段，增强鉴定目的片段亮度，以便确认重组与否。

    pGEX?4T?1载体在GST近BamH I位点处有凝血酶（Thrombin）水解位点，可水解融合蛋白，获取重组HRP5。

【】
  [1]Oppenheim FG，Xu T，McMillian FM,et al．Histatins，a novel family of histidine?rich proteins in human parotid secretion，isolation，characterization，primary structure and fungistatic effects on Candida albicans[J]．Biol Chem，1988，263：7472