肉毒毒素E型重链的生物信息学分析

                       作者：赵国杰， 郝凤进， 关一夫  

【摘要】  目的： 分析肉毒毒素E型重链（BoNT/E HC）的抗原表位及空间结构。方法： 利用在线生物信息学分析工具以及其它分析软件分析重链蛋白的抗原表位和空间结构。结果： 预测并显示了肉毒毒素E型重链的空间结构图，以及9个可能的重链的B细胞抗原表位，静电势图揭示了重链分子结构域的两性特点。结论： 抗原表位的预测对于E型肉毒毒素相关诊疗试剂的开发有指导意义，而结构域的极性分析提示其等电点的不同可能在pH介导的穿膜中起了作用。

【关键词】  肉毒毒素类； 抗原； 表位，B淋巴细胞； 氨基酸序列； 基因重排，B淋巴细胞，重链

Bioinformatic Analysis of Botulinum Neurotoxin

    ［Abstract］ Objective: To analyze botulinum neurotoxin type E heavy chain (BoNT/E HC) antigen epitopes and its spatial structure. Methods: Online bioinformatic analysis tools and some other analysis softwares were used. Results: Tertiary structure of BoNT/E HC chain was anticipated and demonstrated. Nine possible antigen epitopes of the HC were predicted, and electrical potential map revealed the amphoteric domains of the HC. Conclusions: The predicting of antigen epitopes is of importance to the exploiting of BONT/E related agents, and domain analysis suggests domain′s pI is important to pH mediated membrane-passing.

    ［Key words］ botulinum toxins; antigens; epitopes,B-lymphocyte; amino acid sequence; gene rearrangement,B-lymphocyte,heavy chain

    　　肉毒毒素是肉毒梭菌分泌的外毒素，具有抑制外周神经末梢释放胆碱神经递质，麻痹肌肉的毒性作用，微克量级的毒素可致成人死亡，它被认为是已知的毒性最强的物质。肉毒毒素根据血清型分为A、B、C、D、E、F和G7个类型，对人类常见的致病血清型主要是A、B和E型。对于肉毒毒素的结晶和结构分析的相关研究主要集中在A、B两型，而且各型抗原性差别主要在于重链，尤其是受体结合结构域。2007-2008年，利用生物信息学技术，对E型重链的三级结构以及抗原表位进行了分析，判定其潜在的抗原表位，为E型肉毒毒素相关的诊疗试剂的开发提供理论依据。同时，在肉毒毒素中毒机理的相关研究中，分析了BoNT/E HC（heavy chain）的不同结构域的等电点，绘制出三维的静电势图像，显示了组成HC的2个结构域的酸碱双极性，提示在pH诱导的穿膜机制中，这种不同亚基的等电点和静电势的差异是重要的分子理化基础。

    1  材料与方法

    1.1  BoNT/E HC蛋白的氨基酸序列及结构分析

    　　从NCBI网站GenBank获取全长BoNT/E型肉毒毒素的氨基酸序列（GenBank accession number CAA44558）［1］。第一位M翻译后被切去，其全长共1 251个aa，近前1/3位置处的G419-R421三肽被蛋白酶切去后，单链蛋白分为轻重2条肽链，其中重链编码830个氨基酸（K422~K1251），轻链编码418个氨基酸（P1~K418）［2］。轻链和重链通过二硫键而连接在一起。重链的氨基酸序列如图1所示。

    1.2   BoNT/E HC的基本理化性质

    使用anthewin软件分析BoNT/E HC全长，以及2个各约50 kD的结构域，即重链N末端的跨膜转运结构域HN (K1~Y408)和重链C末端的神经细胞特异性结合结构域HC (T409~K830)的等电点。

    1.3  BoNT/E HC的抗原表位预测

    　　使用anthewin软件系统分析，采用其中的GOR算法，预测二级结构，寻找转角易形成区域；采用Hopp & Woods算法，进行亲水性预测，预测蛋白质中的亲水区域；采用Boger & al.算法，进行可及性预测，预测蛋白质中的溶剂可及性区域；采用Parker方案，进行抗原性指数分析，分析抗原性。对各个参数的结果进行综合分析，最后确定B细胞表位的可能位点［3］。

    1.4  BoNT/E HC的空间结构预测

    　　利用在线的SWISS-MODEL软件进行3级结构的同源建模，预测蛋白质的空间构象，并通过Vector NTI suite软件显示蛋白质的3D结构图，并将BoNT/E HC的抗原表位标记在三维结构图上［4］。利用Swiss-PdbViewer 3.7BoNT/E HC的静电势并显示三维图像。

    2  结果

    2.1  BoNT/E HC的一般理化性质分析

    　　利用anthewin软件对BoNT/E HC和其HN结构域和HC结构域进行理化性质分析。HC全长分子量为95.7 kD，等电点为5.175。HN结构域的等电点为4.365，HC结构域的等电点为9.145。

    2.2  BoNT/E HC的B细胞抗原表位的预测

    　　本研究从4个方面对BoNT/E HC的抗原表位进行预测，即二级结构中形成转角的可能性、亲水性、可及性和抗原性。Anthewin软件的具体分析结果见图2和表1。

    综合不同的预测方法，发现其共有序列为：18-32、78-83、193-199、274-279、433-441、521-526、574-579、675-682、801-811，即为预测的可能的B细胞抗原表位。其中18-32、78-83、193-199、274-279 4个表位位于HN结构域，433-441、521-526、574-579、675-682、801-811 5个表位位于HC结构域。

    2.3  重链的三维结构图以及预测的线性表位的位置表1  BoNT/E HC的B细胞抗原表位分析氨基酸序列与蛋白结构数据库中的蛋白质3级结构进行匹配，将结果在vector NTI suite软件中打开，观察BoNT/E HC的三维结构和结构域组成。如图2所示，BoNT/E HC分子含有2个结构域，分别为HN跨膜转运结构域和HC神经细胞特异性结合结构域，前者含有2个α螺旋和1个loop结构，后者包含2个亚结构域。

    　　利用vector NTI suite软件将预测的抗原表位标记在结构图中，观察表位所处的空间位置，验证预测的抗原表位的可行性。如图3、图4所示，分析结果为所预测的抗原表位均位于BoNT/E HC的蛋白质分子表面，其中HN结构域中的274-279表位可能会受到loop结构的空间位阻的影响，HC结构域中的574-579表位可能会受到α螺旋的部分影响，其余的7个抗原表位均有较好的空间可及性。注：左侧为HC神经细胞特异性结合结构域，右侧为HN跨膜转运结构域的2个α螺旋和loop结构，箭头所示为抗原表位的位置
 
    2.4  BoNT/E HC的静电势

    　　将SWISS-MODEL的3级结构预测结果在Swiss-PdbViewer中打开，静电势并图像显示。如图5所示，该蛋白的HN结构域的电负性很强，而HC结构域的电正性很强，这与该蛋白质做理化分析时发现的这2个结构域的等电点分别为4.385和9.165相一致。注：图中红色表示电负性，蓝色表示电正性。可见HN结构域的2个α螺旋和 loop为电负性，HC结构域为电正性

　　3  讨论

    通过NCBI的GenBank中找到BoNT/E全长的氨基酸序列，其中K422~K1251共830个氨基酸为毒素重链，重链HC可以划分为HN跨膜转运结构域和HC神经细胞特异性结合结构域。

    　　虽然对BoNT的A型、B型的全长结晶结构研究较多，但E型仅有对其轻链的结晶结构研究报告。本文利用在线的SWISS-MODEL软件预测并绘制了BoNT/E重链的空间结构图，三维图像显示其N末端为HN结构域中套索状的的loop结构，中间区域为HN结构域中的2个长α螺旋为中心形成的圆柱体，C末端为HC结构域中的2个亚结构域，分别是近N端的lectin-like domain和受体结合域所在的近C端的β-trefoil fold［5，6］。此三维图像显示的结构与中描述的A型和B型肉毒毒素的结构相一致。

    　　利用生物信息学软件anthewin中的2级结构分析、抗原性分析、亲水性分析和可及性分析，综合分析BoNT/E HC的抗原表位，共在HN结构域中找到4个抗原表位18-32、78-83、193-199、274-279，在HC结构域中找到5个抗原表位433-441、521-526、574-579、675-682、801-811。将这9个表位利用vector NTI suite软件标在该蛋白的三维立体结构图中，提示表位272-277可能会受到loop结构的空间位阻的影响，表位572-577可能会受到α螺旋的位阻影响，其余的7个抗原表位均有较好的空间可及性，从而验证了抗原表位的可行性，并为合成抗原肽、制备该蛋白的特异性抗体、开发疫苗和检验试剂提供了理论依据。通过肉毒毒素A、B和E 3型间的序列比较，分析所得的抗原表位序列的保守性，可以发现78-83、274-279、675-682、801-811的保守性差，可以考虑用作肉毒毒素的型间鉴别。另一方面，通过对这些潜在的抗原位点进行改造，获得低免疫原性的毒素分子，有望解决肉毒毒素在美容抗皱中出现的耐受现象。刘艳华等［7］对E型肉毒毒素重链的抗原表位也做了预测，比较发现与本文预测的274-279、433-441、675-682 3个位点与其相同，其他位点均不同，可能与不同的预测方法有关，实际的可行位点还需通过免疫实验进一步验证。

    　　由于肉毒毒素分子亚基的相对独立性和划分的相对明确性的特点，使得我们可以将亚基作为独立的多肽链进行分析。BoNT/E重链的HN、HC的理化性质显示，HN的pI为4.385，HC的pI为9.165。利用Swiss-PdbViewer软件，计算并显示BoNT/E HC的三维结构静电势图，显示HN结构域有较强的电负性，HC结构域有较强的电正性，这与结构域的等电点预测相一致。众所周知，肉毒毒素可以结合胆碱能神经元末稍，并使其轻链进入胞浆，抑制神经递质囊泡的释放。具体机制的探讨中发现，被吞入内体中的毒素分子在酸性环境中，重链HN跨膜转运结构域可以穿入内体脂双层膜，形成跨膜通道，并将轻链送入胞浆，而HN的具体穿膜机制尚不清楚［8，9］。本文对BoNT/E分子的不同结构域的等电点分析以及静电势分析中，可以给出以下推测，肉毒毒素通过肠道入血液后，在pH约7.4的中性环境中，HN和HC结构域分别带较强的负电荷和正电荷，表现为较强的极性，有较好的水溶性，当毒素和神经细胞受体结合并被吞入内体中，进入pH约5的酸性环境中，从而使HC端的极性增强而HN端的极性减弱，进而有利于HN的穿膜，至于HC端的极性增强对毒素和受体分子亲和力的影响尚不确定。

【文献】
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