海洛因依赖对大鼠垂体β?内啡肽表达的影响

                              作者：梁文妹， 李一欣， 夏白娟， 潘贵书

【摘要】  目的： 探讨海洛因依赖对大鼠垂体远侧部β?内啡肽（β?endrophin，β?EP）表达的影响。方法: 成年雄性SD大鼠55只，随机分为正常对照组、盐水对照组及海洛因依赖组；皮下注射海洛因建立海洛因依赖大鼠模型，分别于模型建立的第10、17、24、31、38天取垂体组织，应用免疫组织化学SABC法、图像分析法观察大鼠垂体远侧部β?内啡肽表达。结果: 与正常对照组和盐水对照组比较，海洛因依赖组大鼠垂体远侧部β?EP免疫反应明显减弱，平均灰度值增高(P＜0.05)。结论: 在海洛因依赖期间，垂体远侧部β?EP表达减少，提示海洛因依赖使内源性阿片样物质的产生受到抑制。

【关键词】  海洛因依赖； β内啡肽； 垂体； 免疫组织化学；大鼠，Sprague?Dawley

　　［Abstract］Objective: To investigate the effect of heroin dependence on the expression of β?endrophin (β?EP) in pars distalis hypophyseos for exploring the possible mechanism of the changes. Methods: Fifty?five male adult SD rats were randomly divided into a normal control group (group NCG), a saline control group (group SCG) and a heroin dependence group (group HDG). Heroin?dependent rat models were set up by subcutaneous injection of heroin and the hypophysis were excised on the 10th, 17th, 24th, 31th, and 38th days after models were set up. Immunohistochemical SABC method, imagine analysis, and radioimmunoassay were used in the research. Results: Compared with those of groups NCG, and SCG, the immune staining intensity of β?EP cells in group HGD was weaker, and the average gray value was significantly higher (P<0.05).Conclusions: β?EP positive cells diminish during heroin dependence, The morphological and functional changes suggest that heroin inhibit the production of endogenous opioid.

　　［Key words］ heroin dependence; beta?endorphin; pituitary gland; immunohistochemistry; rats, Sprague?dawley

    对海洛因及阿片类药物依赖形成机制的探索认为，持续性外源性阿片药滥用，使阿片受体细胞处于“超载”状况，通过负反馈机制导致对内源性阿片肽“废用性”减少，内啡肽水平下降是阿片药物依赖和耐受的主要机制之一，因而内啡肽与阿片依赖和耐受的关系日益受到重视[1～4]。β?内啡肽（β?endrophin，β?EP）是上世纪70年代末发现的内源性阿片样物质，主要在下丘脑和垂体内合成和储存[3，4]，目前尚未见用形态学方法对海洛因依赖期间β?EP在垂体表达的研究报道。2007-2008年通过建立海洛因依赖大鼠模型，应用免疫组织化学和图像分析法对大鼠海洛因依赖期间垂体β?EP阳性细胞进行了形态观察，旨在探讨海洛因依赖对垂体β?EP分泌表达的影响，以期为研究毒品依赖的机制提供依据。

　　1  材料和方法

　　1.1  动物分组和海洛因依赖大鼠模型 

　　成年雄性SD大鼠55只，体重180～220 g，贵阳医学院实验动物中心提供。按配对原则随机分为正常对照组5只，盐水对照组25只，海洛因依赖组25只。海洛因依赖实验动物按已建立的方法制作[5]：按体重逐日递增皮下注射海洛因药液(纯度为61.48 %，由贵州省公安厅提供)，首日剂量为3 mg/kg，2次/d（上午8时，下午3时）；连续9 d至成瘾，第9天剂量为27 mg/kg。此后每日仅上午8时皮下注射海洛因1次，剂量27 mg/kg，维持至取材。盐水对照组大鼠按体重每日注射与依赖组相同剂量的生理盐水为模拟模型；正常对照组不予任何处理，常规喂养。

　　1.2  取材和标本制备 

　　海洛因依赖组及盐水对照组大鼠分别于模型建立的第10、17、24、31、38天取材，每次每组处死5只，处死正常对照组大鼠1只。各组取垂体标本，多聚甲醛液固定，常规石蜡包埋，制成4 μm厚的连续切片，切片间隔56 μm。

　　1.3  β?EP表达 

　　用免疫组织化学SABC法显示β?EP表达阳性细胞。主要步骤为：切片常规脱蜡至水，10%甲醇-H2O2，正常羊血清（1∶50），滴加1抗（兔抗β?EP 1∶50，武汉博士德生物技术有限公司），4 ℃孵育过夜，羊抗兔IgG （1∶100），SABC复合物（1∶100武汉博士德生物技术有限公司），DAB?H2O2液显色，苏木精复染细胞核。PBS代替特异性抗血清作为方法对照。

　　1.4  图像分析 

　　随机选取第10、17、24、31、38天海洛因依赖组与盐水对照组切片，每组每个时间点3例，正常对照组3例，应用BioMias图像分析系统进行检测。在40倍物镜下，每例随机选取5个视野，测β?EP阳性细胞的平均灰度值。应用SPSS11.5软件包对所得数据进行统计分析，P<0.05差异具有显著性。

　　2  结果

　　2.1  免疫组织化学观察 

　　经DAB?H2O2液显色，光镜下可见垂体β?EP阳性的细胞内免疫反应产物呈棕黄至棕黑色细颗粒状，存在于胞质内（图1A）。对照实验结果均为阴性反应。与正常对照组比较，盐水对照组各时间点β?EP阳性细胞的分布、数量及细胞免疫染色强度未见明显区别（图1B、1C）。海洛因依赖组大鼠垂体β?EP阳性细胞免疫染色的反应强度减弱（图1D、1E、1F）。表1  各组大鼠垂体β?EP阳性反应细胞的平均灰度值(略)

　　2.2  图像分析 

　　大鼠海洛因依赖期间垂体β?EP阳性细胞平均灰度值如表1所示，海洛因依赖组β?EP阳性细胞的平均灰度值明显增高。大鼠海洛因依赖期间垂体β?EP阳性反应细胞图像分析和形态计量的结果与同期的形态观察结果基本一致。

　　3  讨论
      
　　内啡肽是体内产生的具有类似吗啡作用的肽类物质。体内β?EP来源于前阿黑皮素原 (POMC)，POMC含有约230个氨基酸，在不同种属稍有差异，其中β?EP的31个氨基酸构成了它的C末端。β?EP在垂体前叶及中叶中有很高浓度，在下丘脑、杏仁核、丘脑室周核、脑桥-延髓部及导水管周围灰质中亦有很高浓度 [6，7]。有研究报道，吗啡成瘾后，大鼠垂体中β?EP样免疫活性物质含量减少(P<0.01)[3]，海洛因依赖大鼠下丘脑、中脑中央灰质、垂体和血浆中的β?EP的含量均较对照组显著下降(P<0.05或P<0.01)[4]，海洛因依赖者上午8时内啡肽、ACTH和皮质醇均明显降低 [8]。本实验采用免疫组织化学和图像分析方法，对垂体β?EP阳性细胞进行研究，发现在海洛因依赖期间，大鼠垂体远侧部细胞β?EP表达减少。因此认为，海洛因依赖能使β?EP的分泌受到抑制。由于β?EP有很强的镇痛作用，其效价数十倍于吗啡 [9]，故海洛因依赖者较严重的戒断症状之一就是难以忍受的全身性剧痛[8]，推测这与阿片依赖期间，由于外源性阿片物质进入机体，与阿片受体竞争结合，抑制了内源性阿片肽的产生[10，11]，但究竟是通过哪些具体机制和途径抑制内源性阿片肽合成分泌，尚需要进一步探讨。

【】
  　　[1]Soverchia L, Mosconi G, Ruggeri B，et al. Proopiomelanocortin gene expression and beta?endorphin localization in the pituitary, testis, and epididymis of stallion[J]. Mol Reprod Dev,2006(1):1-8.

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　　[3]杨国栋,顾钧,叶明珠,等.东莨菪碱对吗啡成瘾大鼠下丘脑、垂体及血β?内啡肽和催产素含量的影响[J]. 中华医学杂志,1995（1）：8-10.

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　　[5]潘贵书,徐国强,李淑芳,等. 海洛因成瘾大鼠模型的建立[J]. 贵阳医学院学报,1997(增刊):46-46.

　　[6]韩济生.神经纲要[M].北京：北京医科大学协和医科大学联合出版社，1993:465.

　　[7]Fukuda Y, Kageyama K, Nigawara T, et al. Effects of corticotropin?releasing hormone (CRH) on the synthesis and secretion of proopiomelanocortin?related peptides in the anterior pituitary: a study using CRH?deficient mice[J]. Neurosci Lett,2004(2):201-204.

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　　[10]杨良,李红. 海洛因依赖基础医学与临床医学[M].昆明：云南科技出版社，1998:33.

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