家蝇幼虫防御素基因的克隆和序列分析

【摘要】  目的： 克隆家蝇幼虫防御素（defensin）基因并进行序列分析。方法：根据Genbank公布的家蝇成虫defensin基因序列设计一对引物，以家蝇幼虫基因组DNA为模板，进行PCR扩增、测序，并利用软件进行序列分析。结果： 克隆得到的defensin基因的长度为330 bp，编码92个氨基酸，4个阳性克隆的DNA序列编码的多肽在第27位氨基酸残基不同，为K或N。结论： 从家蝇幼虫基因组DNA中克隆得到了defensin基因，发现了两种相差一个氨基酸残基的defensin前体蛋白，并初步预测了两种前体蛋白的化学性质和二级结构，为该基因的重组表达奠定了基础。

【关键词】  防御素类； 家蝇； 幼虫； 克隆，生物； 序列分析

　　［Abstract］ Objective: To clone the defensin genes of Musca domestica larvae and analyze their sequences．Methods: PCR was carried out to obtain the gene fragment with the genomic DNA of M. domestica larvae as template, and the primers used were designed following M. domestica adult defensin gene sequence in Genbank. The PCR products were purified and cloned into plasmid T?vector, and sequenced. Results: The amplified products were about 330bp, and were deduced to encode 92 amino acids. Five Single Nucleotide differences of sequences exited among four clones. Two kinds of deduced amino acid sequences of defensin gene were gained from M.domestica larvae in this experiment. Conclusion: Defensin gene of M. domestica larvae has been cloned successfully. Two kinds of defensin precursor proteins were found, which lays foundation for further research on recombinant defensin expression and its antibiotic activety.

　　［Key words］ defensins； houseflies; larva; cloning, organism; sequence analysis

    滥用抗生素带来了日益严重的微生物对抗生素的耐药性问题，因此发现和筛选具有新的作用机理的抗菌药物已经成为当前医药研究领域的迫切任务。昆虫抗菌肽是一类生物活性小分子肽，具有热稳定性强、杀菌力强、抗菌谱广和无免疫原性的特点，可以抑杀某些真菌、细菌、病毒及原虫，并对多种癌细胞及动物实体瘤有明显的杀伤作用,且不会破坏正常细胞[1，2]，其突出的优势在医药领域展示出良好的应用前景，将成为新一代的抗菌、抗病毒、抗癌药物。家蝇(Musca domestica)与其他昆虫相比对病原微生物有着更为强大的免疫力，大量的研究结果显示家蝇的强大免疫力正是因为体内存在着抗菌[3]、抗病毒[4]、抗真菌[5]的活性分子。防御素（defensin）是抗菌肽家族中最为普遍的一类，并且在不同物种中有很高的保守性，具有广谱的抗菌和调节机体免疫系统的作用。由于天然抗菌肽的来源少，纯化工艺的难度与高成本，无法满足临床试用和基础研究的需要。因此，通过基因工程技术生产防御素，无疑是降低成本和大量生产的有效途径。近年来，王来城[6]和许琴英[7]分别通过构建cDNA文库先后克隆了广东家蝇幼虫和山东家蝇成虫的defensin基因，家蝇防御素在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达也获得了初步成功[8，9]；王婷婷等[10]构建了有利于家蝇defensin基因高效表达的同向串联表达载体。在这些研究中，家蝇防御素基因的获得均是通过从抽提家蝇RNA或是建立的cDNA文库中来扩增该基因，目前尚未见从家蝇基因组中克隆defensin基因的报道。本研究以贵州贵阳的家蝇幼虫作为实验材料，直接抽提幼虫基因组DNA，用PCR方法克隆defensin基因，并与其cDNA相比较，了解其基因结构，为下一步建立该基因高效稳定的表达体系奠定基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  家蝇幼虫来源 

　　由贵阳医学院昆虫分子生物学实验室提供。

　　1.1.2  E．coli JM109菌株 

　　本实验室保存的E.coli JM109菌株，Taq聚合酶、DNA Marker、pMD-18T载体试剂盒、M13引物、限制性内切酶等购自大连宝生物公司，PCR引物由大连宝生物公司合成，其余试剂均为进口或国产分析纯。

　　1.2  方法

　　1.2.1  基因组DNA的提取 

　　取3只三龄幼虫，约30 g，参照安春菊[11]的方法抽提幼虫基因组DNA。

　　1.2.2  PCR扩增和产物鉴定 

　　扩增反应体系为50 μl，模板DNA 1 μl，10×PCR Buffer 5 μl， TaqDNA聚合酶0.5 μl，25 mmol/L dNTPs 4 μl，10 μmol/L物引2 μl，水35.5 μl。PCR扩增程序为：94 ℃预变性2 min后进入扩增循环，94 ℃变性40 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后，用1.5 %的琼脂糖凝胶电泳0.5 h ,溴化乙锭染色法检测PCR产物。引物根据Genbank发表的防御素同源序列AY260152.1，利用Premier 5.0引物设计软件设计引物：上游引物为5’-ACCATCCAACCCAACCAGCCATC-3’；下游引物为5’-ACAACACCTCAGTTACGGCAAAC-3’。

　　1.2.3  扩增产物的克隆  

　　用乙醇沉淀的方法纯化PCR产物，将其与pMD?18T载体连接，16 ℃连接3 h。转化宿主菌E．coli JM109，在涂有X?gal和IPTG的氨苄青霉素培养基上随机挑取白色菌落，提取质粒进行PCR鉴定和酶切鉴定。

　　1.2.4  目的基因的序列测定和分析
 
　　随机挑选4个经过PCR法和双酶切法鉴定的阳性克隆送大连宝生物公司测序。登陆NCBI网站，对序列进行同源性分析，通过ORF Finder寻找可能的阅读框，将得到的序列按照最佳的阅读框进行翻译，并运用生物学信息软件对目的基因的结构和主要生物学特征进行分析和预测。

　　2  结果

　　2.1  总DNA的提取和质量鉴定
        
　　以家蝇的三龄幼虫为材料抽提DNA的电泳图见图1A。经紫外分光光度计测定， 提取的DNA，在260 nm处与280 nm处吸光度的比值为1.7～
　　1.9，纯度较高，可用作下一步PCR扩增的模板DNA。

　　2.2  PCR扩增结果及重组质粒鉴定
    　　
　　以三龄幼虫基因组DNA为模板，用设计的引物进行PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳显示得到一条300 bp左右的清晰条带（图1B）。重组质粒采用PCR法和双酶切法鉴定，PCR法以M13引物进行扩增，双酶切法采用Hind Ⅲ和BamHⅠ进行酶切，电泳后均得到一条500 bp左右的特异条带者为阳性克隆，图2。

　　2.3  defensin基因生物信息学分析

　　2.3.1  核酸序列分析 

　　测序结果显示，4个阳性克隆（编号为1、2、3、4）中，序列1、3、4长度均为330 bp，序列2长度为229 bp。ORF Finder分析，最大开放性阅读框为276 bp，起始密码为ATG，终止密码为TGA，编码92个氨基酸。登陆NCBI网站，运用Blast进行同源性分析，结果表明该序列与其它昆虫防御素的相似性很高，与王来城[6]报道的家蝇成虫的defensin基因序列一致性为92%，所编码氨基酸的一致性为95％，与许琴英[7]报道的家蝇幼虫defensin基因序列一致性为90%，所编码氨基酸的一致性为93%。DNAMAN软件对4个阳性克隆的DNA序列进行多序列比对，结果显示4条序列共存在5处单碱基差异（图3），其中有3处位于读码框内。4条序列所编码的氨基酸序列在第27位氨基酸残基不同（图4，两条序列分别命名为前体蛋白A和前体蛋白B），其中前3条序列编码的为K（赖氨酸），与许琴英[7]所报道的相同；一个克隆为N（天冬酰胺），与王来城[6]所报道的相同。

　　2.3.2  defensin基因编码蛋白结构的预测 

　　登陆ExPASy网站，运用软件对目的片段的氨基酸序列及二级结构进行预测和分析。克隆所得denfensin基因对应的两种前体蛋白的等电点和理论分子量分别为8.75、9 859.34 kD，8.53、9 845.27 kD；二级结构预测见图5，主要以α-螺旋为主，其次是自由卷曲、β-折叠和β-转角。应用Tmpred软件进行跨膜区分析，发现第3～21位之间有一跨膜区，方向为由胞内到胞外。SignalP软件分析，信号肽位于1～22氨基酸残基。这些结构特点均符合昆虫防御素的典型特征。

　　3  讨论

    以贵州贵阳家蝇幼虫基因组DNA为模板，克隆了defensin基因，经过与cDNA序列比较，发现家蝇defensin基因不含内含子。因此，在该基因的重组表达上，可以选择直接从基因组扩增该基因进行表达，更加简便快捷，避免了提取RNA或构建cDNA文库时的繁琐操作，克服了RNA易降解，不利于保存等缺点。
    　　
　　同源性比对结果显示，本实验所得幼虫的defensin基因序列与报道的家蝇成虫同源性高于幼虫，推测可能是由于不同地理株间的差异造成的，而且差异均显示在N端的信号肽或前导肽区域，而成熟肽区域是高度保守的，这与许琴英等[5]的报道一致。
    　　
　　随机选取4个阳性克隆进行测序，发现4条序列存在5处单碱基差异，由于氨基酸的简并性，得到了两种只相差一个氨基酸残基的defensin前体蛋白，该位点的氨基酸残基分别与王来城[4]和许琴英[5]报道的一致。由于这两种氨基酸残基的性质不同，所形成的前体蛋白在的二级结构上略有差别（图7），认为这种差异不是测序误读造成的，而是家蝇防御素基因存在基因多态性，或者是家蝇雌雄差别所造成的。不同性质的氨基酸残基组成，往往会对蛋白的抑菌活性有影响[12]。因此，今后的研究将分别抽提单只雌雄家蝇的基因组DNA克隆defensin基因，然后进行生物信息学的比较分析；或将本实验克隆的两种defensin基因分别进行重组表达，研究其差异，从而为高效表达defensin基因奠定基础。

【】
  　　[1]Lamberty M，Zachary D，Lanot R， et al．Insect immunity Constitutive expression of a cysteine-rich antifungal and a linear antibacterial peptide in a termite insect[J]．J Biol Chem，2001(6)：4085-4092．

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　　[4]陈艳，吴建伟.家蝇幼虫营养价值及抗病毒活性的初步研究[J].贵阳医学院学报,2002(2）：100-103.

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　　[8]王来城 王金星.家蝇防御素在大肠杆菌中的表达、纯化与抗体制备[J].动物学报，2005(2)：327-334.

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　　[10]王婷婷，金小宝.家蝇抗茵肽Defensin基因同向串联表达载体的构建和鉴定[J].生物技术，2006（2）：3-5.

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