辛伐他汀对糖尿病大鼠肾脏活化蛋白-1表达的影响
【摘要】 目的： 研究活化蛋白-1（AP?1）在糖尿病大鼠肾脏中的分子机制，探讨辛伐他汀对AP?1的影响及机制。方法： 大鼠随机分成正常对照组（C组）、糖尿病组（DM组）和辛伐他汀组（DS组），用原位杂交方法检测各组肾组织AP?1（c?jun mRNA）的表达，免疫组织化学法检测各组肾组织巨噬细胞炎症蛋白?1α（MIP?1α）及纤维连接蛋白（FN）的表达，生化法测定各组血糖、总胆固醇、甘油三酯、肌酐及24 h尿蛋白。结果： DM组AP?1 的活性和MIP?1α的表达明显高于C组（P<0.01），DS组AP?1 活性降低、MIP?1α和FN低表达（P<0.01）、24 h尿蛋白排泄减少（P<0.01）、改善肾功能指标及肾组织病损害。结论： AP?1在糖尿病肾病发生中具有重要作用，辛伐他汀抑制AP?1 活性可能是其非降脂性肾脏保护的机制之一。
【关键词】 糖尿病肾病 活化蛋白 1 巨噬细胞炎性蛋白质 西司他汀类
［Abstract］ Objective: To study the molecular mechanism of activator protein?1(AP?1) in renal tissues of diabetic rats, and to investigate the effects of simvastatin on AP?1 and its protection to kidney during the development of diabetic nephropathy (DN). Methods: SD male rats were randomly divided into three groups: normal control group (C), diabetic group (DM), and simvastatin treated group (DS).The expression of AP?1（c?jun mRNA）in renal tissues was measured with in situ hybridization.The expressions of macrophage inflammatory protein?1α (MIP?1α) and fibronectin (FN) were measured with Immuno? histochemstry method. The levels of triglyceride (TG), total cholesterol (TC), creatinine(Cr) and 24?hour urine protein excretion were measured with biochemistry methods. Results: The expressions of AP?1, MIP?1α and FN in glomeruli were increased in group DM and were inhibited by simvastatin treatment(P<0.01). The levels of 24?hour urine protein, TG,TC and Cr in group DS were lower than those in group DM(P<0.01). The renal histology changes were markedly relieved in group DS as compared with that in group DM. Conclusions: AP?1 plays an important role in the development of diabetic nephropathy. One of Reno?protective effects of simvastatin might be inhibition of AP?1 activity.
［Key words］ diabetic nephropathies; activato protein?1; macrophage inflammatory protein?1; cystatins
糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）的发病机理及影响因素比较复杂，至今尚不完全清楚，目前认为糖代谢紊乱、肾局部血流动力学改变、细胞因子等因素均发挥着重要的作用[1]。活化蛋白-1（AP?1)是一种转录因子，许多与肾脏疾病进展有关的细胞因子，如转化生长因子β1（TGF?β1）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP?1）、白介素-1β（IL?1β）基因启动子上含有AP?1的结合位点[2]，提示AP?1可能对DN的发生发展有重要作用。实验表明他汀类药物有保护肾脏作用，但机制仍不甚清楚。本实验通过观察AP?1在糖尿病大鼠肾组织中的表达及辛伐他汀对它的影响，探讨辛伐他汀对肾脏保护作用及其机制。
1 材料与方法
1.1 材料
链脲佐菌素（STZ，sigma公司），辛伐他汀（鲁南贝特制药有限公司，批号20030705）；c?jun mRNA原位杂交试剂盒，巨噬细胞炎症蛋白?1α鼠型抗体，纤维连接蛋白（FN）鼠型抗体，SABC试剂盒，DAB显色剂为武汉博士德公司产品；健康纯种♂SD大鼠30只，体重210～240 g（贵州省实验动物中心）；雅培2000型自动生化分析仪。
1.2 方法
1.2.1 糖尿病大鼠模型
动物适应性喂养1周，建立模型前12 h禁食、正常饮水，糖尿病组及辛伐他汀治疗组采用2%STZ（新配，溶于0.1 mol/L枸橼酸缓冲液，pH4.5）60 mg/kg一次性腹腔注射，对照组注射等量枸橼酸缓冲液。72 h后，剪尾取血，One TouchⅡ型血糖仪（美国强生公司）测定末梢血糖，血糖值≥16.5 mmol/L确定为模型制备成功。
1.2.2 动物分组及给药
30只大鼠随机分成3组，分别为C组（正常对照组）；DM组（糖尿病组）；DS组（糖尿病+辛伐他汀治疗）。糖尿病模型建立后，DS组予辛伐他汀1 mg/（k·d）灌胃，DM组及C组喂等量饮用水。实验期间大鼠自由饮水、进食，不使用胰岛素及其他降糖药物。
1.2.3 标本的收集及处理
第8周用代谢笼收集各组大鼠24 h尿液，置-20 ℃冷藏待测；股动脉放血5 ml，肝素抗凝；处死大鼠，迅速取出右肾，4 ℃生理盐水冲洗2次，小心剥去肾包膜，肾组织横切为约1 mm的薄片，置4%多聚甲醛缓冲液中固定4 h，常规脱水、浸蜡、包埋后制成蜡块，切片（厚度3 μm）。原位杂交检测各组肾组织AP?1（c?jun mRNA）的表达，免疫组织化学法测定肾组织中MIP?1α、FN的表达，常规肾组织苏木素-伊红染色（HE）和 过碘酸（PAS）染色。生化法测定血清肌酐（Cr）、血糖(Glu)、总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)及24 h尿蛋白。
1.2.4 肾组织AP?1（c?jun mRNA）及MIP?1α光镜观察
每例标本按左上、左下、右上、右下、中间的顺序取肾皮质20个肾小球，高倍视野下（×400）分别观察肾小球中c?jun mRNA（细胞浆呈棕褐色）、MIP?1α（细胞浆呈棕褐色）阳性细胞数，均值表示每例肾小球中阳性细胞数。
1.2.5 PAS染色阳性基质面积比及FN表达光密度图像分析
PAS染色高倍镜下（×200）观察每张切片肾皮质8个大小相似的肾小球，用 BioMaix彩色图像分析系统（四川大学图像图形研究所）分析每个肾小球PAS染色阳性基质面积、肾小球总面积，求得基质阳性面积比；FN分析采用上述方法测定肾皮质8个肾小球中FN染色阳性（棕褐色）的平均光密度（×400），以均值表示每组光密度。
1.2.6 统计学分析
实验结果以x±s表示，组间比较采用方差分析，相关分析采用直线相关。P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 c?jun mRNA、MIP?1α和FN的表达及PAS染色阳性基质面积比
DM组c?jun mRNA、MIP?1α和FN的表达明显高于C组，而DS组的表达低于DM组，DM组肾小球PAS染色阳性比值和C组有明显差异，DS组肾小球PAS染色阳性比值较DM组减低，见表1、图1～8。表1 各组大鼠肾小球c?jun mRNA、MIP?1α和FN的表达及PAS染色阳性基质面积比（略）注： 与C组相比(1)P<0.01；与DM组相比(2)P<0.01。
2.2 24 h尿蛋白、Cr、Glu、TC、TG
DM组24h尿蛋白、Cr、TC、TG、GLu高于C组，在DS组中，除Glu与DM组无差异外，余4者低于DM组，见表2。表2 各组大鼠24 h尿蛋白、TC、TG、Cr、Glu水平（略）注： 与C组相比(1)P<0.01；与DM组相比(2)P<0.01,(3)P﹥0.05。
2.3 大鼠肾组织病改变
HE染色光镜观察，DM组大鼠肾小球系膜区基质中度增多，系膜细胞中度增生，小管间质散在灶性单个核细胞浸润，DA组上述病理改变均有不同程度的减轻；PAS染色C组未见明显病理改变，DM组肾小球基底膜增厚，细胞外基质明显增多，系膜区扩大， DA组可见细胞外基质增加，但较DM组减少，系膜区扩张较DM组明显减轻。
2.4 肾小球AP?1阳性细胞数与Cr、24 h尿蛋白相关分析
肾小球AP?1 阳性细胞数与Cr、24h尿蛋白量呈明显正相关，r值分别为0.79(P<0.05)和0.80(P<0.05)。
3 讨论
AP?1是一种重要的转录因子，是由原癌基因jun和fos分别编码的Jun和Fos蛋白嵌合而成的二聚体复合物，作为反式作用因子，AP?1能直接或间接地识别或结合在同一顺式作用元件8?12bp核心序列上，参与许多生长因子和细胞因子的基因转录调控，导致机体一系列的生理和病理变化[3]。体内外研究表明，IL?1β、肿瘤坏死因子?α（TNF?α）、血管紧张素II（AngII）可诱导肾小球系膜细胞（GMC）内AP?1活化[4]，而与GMC炎症反应、细胞增殖和细胞外基质积聚有关的炎症介质，如IL?1β、TGF?β1基因启动子上都含有AP?1的结合位点[2]。Eberhardt等[5]的实验表明，通过MAPK通路活化的AP?1和核因子kappaB 致IL?1β增加，从而导致大鼠GMC基质金属蛋白酶-9的大量表达。Sugiura等[6]的研究也证实，下调AP?1的活性可抑制GMC的增殖。本实验研究表明，正常大鼠肾组织中AP?1有少量的表达，提示适量的AP?1活化可能是正常肾脏细胞生理功能所必需。与正常大鼠相比较，DM组大鼠肾小球中AP?1活性增加， 24 h尿蛋白排泄明显增多，Cr升高，且肾组织中AP?1的活性与24 h尿蛋白和Cr水平呈明显正相关，表明DN时肾组织AP?1被异常激活，且参与DN的发生。
MIP?1α是重要的趋化因子，主要趋化单核细胞和T细胞[7]。本研究发现，与正常大鼠相比较，DM组大鼠肾组织MIP?1α表达增加，细胞外基质FN亦表达增加，肾间质散在灶性单个核细胞浸润及成纤维细胞增生，肾小球系膜区基质明显增多，系膜区扩大。MIP?1α基因调控区并无AP?1结合位点，但鉴于多种细胞因子，如TGF?β1、MCP?1、IL?1β基因调控区上有AP?1结合位点，显然，AP?1可调控这些细胞因子及细胞因子而影响MIP?1α的表达，促进单核巨噬细胞在肾组织中浸润，导致细胞外基质增加。值得注意的是，FN基因启动子亦有AP?1结合位点[8]，提示AP?1的活化可直接致细胞外基质的沉积，表明AP?1和MIP?1α活化是DN发生发展的重要机制之一。
高血糖刺激人GMC表达TGF?β1是通过两个毗邻的AP?1位点的激活所实现的，其激活的途径涉及蛋白激酶C（PKC）和P38丝裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）的活化[9]，而TGF?β1是肾组织纤维化发生的关键机制之一[10]。因此，选择性抑制AP?1的活化可能成为防治DN发生发展的一个新靶点。他汀类药物作为一类经典和有效的降脂药物，在肾脏疾病的中已得到广泛的应用，新近研究发现，这类药物具有一定的非依赖降脂的肾脏保护作用，但其机制不明[11]。本研究表明，应用辛伐他汀可抑制AP?1 活性，降低MIP?1α和FN的表达，降低TC、TG水平，减少24 h尿蛋白排泄，改善肾功能指标及肾组织病理学损害。有研究表明[12]，作为羟甲基戊二酰辅酶A（HMG?COA）还原酶抑制剂，他汀类药物可阻断HMG?COA，使细胞内许多蛋白质的异戊二烯化修饰受到抑制，包括G蛋白（如Ras，Rho等），从而影响细胞周期的调控及细胞外信号向核内传递。Kim等[11]研究认为，Ras蛋白及Rho家族蛋白能引起哺乳动物细胞的MAKP家族通路级联活化，而P38MAKP是激活AP?1的通路之一[13]。因此，推测他汀类药物可能通过抑制Ras/Rho—AP?1途径，作为其发挥非降脂肾保护作用的机制之一。
【】
[1]刘志红，黎磊石. 糖尿病肾病发病机制[J]. 中华肾脏病杂志，1999（2）：120-123.
[2]Barton K, Muthusamy N, Chanyangam M, et al. Defective thymocyte proliferation and IL?2 production in transgenic mice expressing a dorminant?negative form of CREB[J]. Nature, 1996(6560):81-85.
[3]Adcock IM.Transcription factors as activators of gene transcription:AP?1 and NF?kappaB [J]. Monalai Arch Chest Dis,1997(2):178-186.
[4]Karin M.The regulation of AP?1 activity by mitogen?activated protein kinases [J]. J Biol Chem, 1995(28):16483-16486.
[5]Eberhardt W, Huwiler A, Beck KF, et al. Amplification of IL?1 beta induced matrix metalloproteinase?9 expression by superoxide in rat glomerular mesangial cells is mediated by increased activities of NF?kappaB and activating protein?1 involves activation of the mitogen?activated protein kinase pathways[J].J Immunol,2000(10):5788-5797.
[6]Sugiura T, Imai E, Moriyama T, et al. Calcium channel blockers inhibit proliferation and matrix production in rat mesangial cells: possible mechanism of suppression of AP?1 and CREB activates[J]. Nephron,2000(1):71-80.
[7]陈慰峰，金伯泉. 医学免疫学[M]. 北京：北京人民卫生出版社，2004：62-63.
[8]Jeon YJ, Han SH, Lee YW, et al. Dexamethasone inhibit IL?1β gene expression in LPS?stimulated RAW 264.7 cells by blocking NF?κB/Rel and AP?1 activation [J]. Immunopharmacology, 2000(2): 173-183.
[9]Wilmer WA, Dixon CL, Hebert C.Chronic exposure of human mesangial cells to high glucose environments activates the P38MAPK pathway[J].Kidney Int, 2001(3):858-871.
[10]Ahn JD, Morishita R, Kaneda Y, et al.Transcription factor decoy for AP?1 reduces mesangial cell proliferation and extracellular matrix production in vitro and in vivo[J]. Gene Ther, 2004(11):916-923.
[11] Kim SI, Han DC, Lee HB. Lovastatin inhibits transforming growth factorβ1 expression in diabetic rat glomeruli and cultured rat mesangial cells[J]. J Am Soc Nephrol,2000(11)：80-87.
[12]Khwaja A, Connolly JO, Hendry BM. Prenylation inhibitors in renal disease [J]. Lancet, 2000( 355):741-744.
[13] Weigert C, Sauer N, Brodbeck K, et al. AP?1 proteins mediate hyperglycemia?induced activation of the human TGF?betal promoter in mesangial cells[J]. J Am Soc Nephrol,2000(11):2007-2016.
