脐带血基础免疫物质分析

【摘要】  　　目的： 通过胎儿脐带血免疫状况的研究，为脐带血有形和无形成分在免疫方面的应用提供理论依据。方法： 应用血液常规检验、试剂盒以及液体闪烁计数仪和流式细胞仪对白细胞分类、免疫球蛋白、细胞因子、脐血T细胞抗原表面标志和脐血有核细胞NK活性进行测定。结果： 与成人外周血中免疫成分相比，胎儿脐带血中IgA和IgE含量明显减少，IgG无明显改变；脐血浆中G?CSF和GM?CSF分别为成人外周血的11.37倍和15.81倍，TNF略低于成人外周血；中性粒细胞接近成人外周血低值，中、晚幼粒细胞数明显低于成人外周血，淋巴细胞与成人外周血相当，NK细胞活性亦略低于成人外周血；脐带血T细胞亚群CD3+、CD4+和CD8+ 细胞数低于成人外周血，而CD34+和CD45RA细胞则高于成人外周血。结论： 脐血中富含大量的G?CSF和GM?CSF等相关造血因子和原始的造血干细胞成分，虽然淋巴细胞的发育多处于幼稚期，但大量相关的免疫细胞和细胞因子均可作为免疫的基础物质。

【关键词】  细胞因子类 免疫球蛋白类 血液 脐带

　　［Abstract］ Objective: To study the immunity state of foetus cord blood, so as to provide theorty basis for the application of immunological substances from foetus cord blood in hematoplasma immunotherapy. Methods： Using blood routine test kits, liquid scintillation counter and flow cytometry to detect leukocyte classfication, immune globulin, T cell antigen surface marker and NK cell respectively. Results：IgA and IgE in cord blood were much less than in adult peripheral blood, but IgG was nearly the same as that in adult peripheral. G?CSF and GM?CSF in cord blood plasma were 11.37 and 15.81 times respectively of those in adult peripheral blood,while tumor necrosis factor (TNF) was a little bit lower, and heterophil granulocyte level was close to the lower limit in adult peripheral blood. Metagranulocyte and myelocyte levels were obviously lower than those in adult peripheral blood.Leukomonocyte level was about the same as that of adult.The counts of subpopulations CD3+,CD4+,CD8+ of T cell in cord blood were significantly lower than those in adult peripheral blood while those of CD34+ and CD45RA were higher.NK cell killing activity was slightly lower than that of adult blood. Conclusion： Relative hemopoiesis factors and native hematopoietic stem cell components, G?CSF and GM?CSF,  are abundant in cord blood and can be widely used in clinical immunotherapy, even though most T lymphocytes in cord blood are in naive stages of development.
　
　　［Key words］ tissue factor; cytokines；immunoglobulins；blood；umbilical cord
       
　　脐血中的有形和无形成分与脐血的免疫活性密切相关，各种活性因子的存在对不同脐血细胞的发育和功能起重要的调节作用[1～3]。这些活性因子和免疫细胞既与脐血造血干细胞或祖细胞的成功移植密切相关,也与脐血中的免疫成分在抗肿瘤中的广泛应用有关。有关脐血中的有形和无形免疫活性成分的检测国内报道很少，研究脐血中相关的基础免疫物质具有十分重要的意义。

　　1  材料与方法

　　1.1  胎儿脐带血

    采自产科健康成人孕妇的足月正常胎儿脐带，胎儿娩出后立即用止血钳夹住脐带，一把止血钳用脐带圈套好，距脐轮1 cm 处夹住脐带，另一把钳与此相距2 cm，并立即剪断脐带。迅速选择母体端脐带血管鼓起处作为穿刺部位，常规消毒采血，肝素抗凝袋搜集，6 h内应用。

　　1.2  免疫球蛋白检测 

　　用酶联免疫吸附方法检测，试剂盒购自美国EIBIO公司，检测方法按试剂盒说明书操作。

　　1.3  细胞因子

　　检测试剂盒G?CSF、GM?CSF、TNF购自北京吉比埃生物技术开发有限公司，检测方法按试剂盒说明书操作。

　　1.4  白细胞分类

　　推制厚薄适宜的血涂片，用瑞特染色法染片。油镜下计数200个白细胞，按其形态特征进行分类，计数各类细胞所占百分比的平均值。

　　1.5  脐血T细胞表面抗原标志

　　1.5.1  淋巴细胞分离 

　　无菌抽取成人外周血2 ml,EDTA抗凝(每毫升加20 g/L EDTA溶液0.5 ml)，Hank's 液等倍稀释，淋巴细胞分层液分离淋巴细胞(1 500 r/min，20 min)，收获单个核细胞层，Hank's液洗3次(1 500 r/min，5 min)，用RPMI?1640完全培养液调制成浓度为1×106/ml细胞，RPMI1640培养液中培养(100 ml/L胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺，100 U青霉素，50 μg链霉素，20 μg PHA?P)。经PHA?P激活24 h后，收集上层细胞悬液备用。

　　1.5.2  淋巴细胞表面标记 

　　调整MNC浓度为1×107/ml于试管中，取细胞悬液100 μl 分别加入CD3、CD4、CD8、CD34和CD45RA荧光标记单克隆抗体各20 μl，分别加入脐带血有核细胞和外周血淋巴细胞100 μl，室温避光孵育30 min。洗涤后制备MNC悬液(1×106/ml)。流式细胞仪检测（FACS Vantage，美国BECKMAN COULTER公司）。每个样品收集2 000个细胞。用FCM软件分析，各标记细胞的百分率，最后数据经SPSS统计软件处理。

　　1.6  脐血杀伤细胞（NK）活性测定
    　　
　　靶细胞的制备：取指数生长期的K562细胞，浓度为1×106/ml，加入3H?TdR，20 mCi/L,37℃,5 ％CO2条件下培养4 h，收集细胞并调浓度为1×105/ml备用。效应细胞制备：制备脐血有核细胞，并种植于培养瓶内4×107/20 ml，37 ℃,5 %CO2条件下培养72 h，收集细胞，并调浓度为1×107/ml备用。混合培养：取96孔培养板，加靶细胞悬液每孔100 μl（细胞对照组除外），再加入效应细胞悬液每孔100 μl（靶细胞对照组除外），混合后培养18 h，收集后液体闪烁分析仪（美国PACKARD公司)测量。NK活性计算公式：脐带血基础免疫物质分析NK细胞活性＝效应细胞(cpm)-细胞对照组(cpm)靶细胞对照组cpm×100%

　　2  结果

　　2.1  免疫球蛋白
    　　
　　脐带血与成人外周血中IgG沒有明显差异，而脐带血中IgA含量明显少于成人外周血（P＜0.002），IgE也明显减少（P＜0.01），见表1。表1  脐带血和成人外周血中免疫球蛋白比较（略）注：(1)P＜0.002，(2)P＜0.01。

　　2.2  免疫相关的细胞因子

　　脐血浆中G?CSF和GM?CSF含量比较丰富，分别是成人外周血的11.37倍和15.81倍, 而TNF含量略低于成人外周血，无明显统计学差异，见表2。表2  脐血和成人外周血中G?CSF、GM?CSF 和 TNF 含量（略）注：(1)P＜0.01 ，脐血与成人外周血比较。

　　2.3  胎儿脐带血白细胞分类

    从表3中可以看出，中性粒细胞基本接近成人外周血的低值，而中、晚幼粒细胞明显少于成人外周血，淋巴细胞数与成人外周血相当。表3  脐血和成人外周血中白细胞分类（略）

　　2.4  T细胞抗原表面标志

　　从表4中可以看出脐血T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+、CD34+细胞数不同于成人外周血，其中CD3+、CD4+和CD8+T细胞数低于外周血，而CD34+、CD45 RA细胞则高于外周血。表4  脐血和成人外周血T细胞抗原表面标志（略）注：(1)P＜0.05，(2)P＜0.01，脐血与外周血比较。

　　2.5  脐带血NK活性 
    　　
　　脐血细胞NK活性略低于成人外周血，与国外报道结果一致

　　3  讨论
    　　
　　胎儿脐带血中含有丰富的人体需要的有形成分和无形成分[4]，为了使这些有效成分、合理的利用，对脐带血中免疫成分的进一步分析是非常必要的。本研究表明，脐带血与成人外周血相比，IgG沒有明显变化，而IgA含量却明显减少，IgE含量也明显减少。进一步研究发现，脐血中除含有免疫球蛋白之外，还含有多种造血刺激因子，其中G?CSF、GM?CSF因子水平高于成人外周血，而TNF水平略低于成人外周血。丰富的造血刺激因子对于脐带血在肿瘤的临床具有重要意义。从有核细胞的分析结果可以看出，脐带血中性粒细胞含量基本接近成人外周血的低值，而中、晚幼粒细胞明显少于成人外周血；淋巴细胞数与成人外周血含量相当。T淋巴细胞的分析可以看出，脐血T细胞CD3+、CD4+、CD8+ 亚群细胞数低于成人外周血，CD4细胞数与成人外周血相似，CD4/CD8 比值高于成人,但CD8细胞数低于成人外周血；而CD34+细胞数明显高于成人外周血中的含量，是成人外周血的7.28倍。脐带血中CD45RA细胞则高于成人外周血，CD45RA细胞的增多显示了脐带血中免疫细胞的原始性，说明脐带血中免疫细胞功能不成熟。抗原表达和功能活性低下，脐血的这种相对低的免疫活性在一定程度上有助于移植后造血细胞功能的重建和减轻GVHD的发生。脐血NK的杀伤活性略低于成人外周血，此点与Pranke P等报道基本相同[5]。NK是高度保守的具有非特异杀伤活性的一类免疫细胞,高表达的穿孔索可以介导细胞毒作用,可以在免疫治疗上充分发挥作用。综上所述，脐血中存在着大量的与免疫相关的有形和无形成分[6]，这些作为免疫治疗的基础可能为今后的临床免疫治疗展示出良好的应用前景。

【】
  　　[1]王利，刘德立. 白细胞介素-2对脐血CIK细胞体外增殖活性的影响[J]. 中华中医学杂志，2005(4): 265-266.

　　[2]刘广金, 郭丽蓉, 乔振华.脐血免疫细胞特性的研究[J]. 白血病·淋巴瘤, 2002(3): 160-161.

　　[3]顾东生,刘 斌,韩忠朝,等.脐带血干细胞的基础与应用研究[J].生命科学,2006(4):323-327.

　　[4]蔡志扬, 钱宝华, 郭峰,等. 脐带血细胞天然免疫功能测定及研究[J]. 深圳中西医结合杂志, 2005(1):39-41.

　　[5]Chen CJ, Tsai CC, Hsieh JF ，et al. A screening platform for compounds with potential immuno?regulatory activities using human cord blood mononuclear cells [J]. Comb Chem High Throughput Screen,2006(10):777-84.

　　[6]Pranke P, Hendrikx J, Debnath G，et al. Immunophenotype of hematopoietic stem cells from placental/umbilical cord blood after culture[J]. Braz J Med Biol Res, 2005(12):1775-89.