RhD阳性血影细胞的制备及应用

                     作者：石明隽，肖瑛， 桂华珍， 张国忠

【摘要】  　　目的： 探讨用不同渗透浓度磷酸盐液（PB）制备的RhD阳性血影细胞的抗原性及其在抗-D 抗体分离中的作用。方法： 用不同渗透浓度PB作为裂解液，将遗传表现型为CCDee的RhD阳性O型红细胞制备成血影细胞，观察其抗原性；以血影细胞为固相抗原，用亲和层析法从抗D含量为0.814 mg/L的健康人血浆中分离抗-D抗体，检测相关指标。结果： pH7.4、30 mmol/L PB制备的血影细胞形态完整，保持较强的抗原性；成功获得抗-D抗体，回收率达到84.65 ％，IgG单体加二聚体含量为99.3 %，不含抗A、抗B血型抗体以及IgA、IgM和血红蛋白。结论： 用pH7.4、30 mmol/L PB制备的血影细胞可作为固相抗原，并能从低效价血浆中分离纯化抗-D抗体。

【关键词】  RhD抗原 抗-D抗体 血影细胞 血浆

　　［Abstract］ Objective: To investigate the antigenicity of RhD ghost cells prepared with different concentrations of phosphate solution (PB) and its application in the separation of anti?D antibody from plasma with low antibody titer. Methods：Red blood cells of O group with positive RhD (genotype CCDee) were employed to prepare ghost cells using PB with concentrations of 40, 30 and 20 mmol/L respectively. Antigenicity of these cells was examined. Anti?D antibody was separated from the plasma containing 0.814 mg/L of anti?D by using affinity chromatography (AC) with the ghost cells as solid antigen. Results： 1. The ghost cells prepared with PB (pH 7.4, 30 mmol/L) kept complete cell morphology and strong antigenicity; 2. The anti?D antibody was separated successfully using AC method from plasma. The recovery rate of anti?D was 84.65%, and contents of monomer and dimmer reached 99.3% of total IgG. No IgA, IgM or hemoglobin was found in the preparation. Conclusion： The ghost cells prepared by PB (pH 7.4, 30 mmol/L) can be used as solid antigen to separate and purify anti?D antibody from plasma with low anti?D titter.

　　［Key words］ RhD antigen，anti?D antibody; ghost cells; plasma

　　抗-D抗体被广泛用于防止RhD同种免疫[1,2]，同时也用于特发性血小板减少性紫癜[3,4]。目前临床使用的抗-D抗体均为人为免疫而得的血源制剂[5]，而因妊娠等免疫而产生的获得性抗D抗体，由于其血液中含量少，没有受到重视而得到利用。2006年用不同渗透浓度的磷酸盐液（PB）制备RhD阳性血影细胞，并探讨其对血影细胞抗原性的影响，探索用血影细胞从含低效价抗-D抗体的血浆中分离纯化抗体的方法及其可用性。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料 

　　健康人血浆（抗D为0.814 mg/L，IgG含量9.63 g/L，贵州省血液中心），Rh表型CCDee的O型红细胞（贵州省血液中心），效价为1∶256的抗D（IgG）血型抗体标准品（上海市血液中心），溶血素（生物制品质量检测所），FITC-兔抗人免疫球蛋白（晶美公司），MININEPHTMIgG抗血清（英国The Binding site公司），99/728抗-D抗体标准品(英国The National Institute for Biological Standards and Control， NIBSC)，免疫单扩散板（上海捷门生物技术合作公司）。8200型超滤器、截留分子量30 kD的超滤膜（美国Millipore公司），3K30型低温高速离心机（德国Sigma公司），FACSCabiber式细胞仪（美国Becton Dickinson公司），高效液相色谱仪（美国Waters公司），MININEPSAN散射比浊仪（英国The Bingding Site 公司）。

　　1.2  血影细胞的制备 

　　O型Rh表型CCDee的红细胞，等体积生理盐水洗涤3次（1 000 r/min×5 min，4 ℃），pH7.4，渗透浓度分别为40、30 和20 mmol/L的PB多次洗涤离心（20 000 r/min×15 min，4 ℃）至上清液无色，沉淀即为含D抗原的血影细胞。

　　1.3  血影细胞形态和抗原性检测 

　　在光镜下观察血影细胞的形态。将血影细胞与标准抗-D抗体37 ℃孵育30 min，离心取上清液，用RhD筛选细胞测定其抗体效价，标准抗-D抗体效价减去上清液效价反映血影细胞的抗原性，相同条件重复5次。

　　1.4  血浆抗D-抗体的分离纯化 

　　血影细胞用2%戊二醛2∶1的体积比固定30 min后与血浆按1∶2的体积比例混合，37 ℃轻柔搅拌2 h，离心（1 000 r/min×5 min，4 ℃）弃上清，沉淀的细胞用10倍体积的pH2.8，0.2 mol/L的甘氨酸－盐酸缓冲液洗脱，离心（ 1 000 r/min×3 min），洗脱液用0.05 mol/L NaOH调pH至6.0～6.5，重复两次，合并洗脱液，超滤浓缩至原血浆体积的1/5，过滤除菌，冷冻干燥，4 ℃保存。相同条件重复7次。

　　1.5  抗体测定 

　　终点散射比浊法测定IgG含量，免疫单扩散法检测IgA和IgM含量，高效液相色谱法测定IgG单体加二聚体含量，流式细胞术测定抗-D抗体含量，邻甲联苯胺法行血红蛋白定性测定，试管法测定抗A、抗B血型抗体。

　　2  结果

　　2.1  血影细胞的形态 

　　用渗透浓度为20 mmol/L的PB制备的血影细胞形态不规则，混有较多细胞碎片；用30和40 mmol/L的PB制备的血影细胞呈透明圆形，未见明显细胞碎片，但40 mmol/L的PB制备的血影细胞内含有少量血红蛋白，细胞中心可见红色。

　　2.2  血影细胞的抗原性 

　　抗-D标准品效价为1∶256，表1显示血影细胞与抗-D抗体标准品孵育后，重复 5次的结果。用20 mmol/L的PB制备的血影细胞与抗-D抗体标准品孵育后，四次上清液中的抗体效价为1∶128；而用30和40 mmol/L的PB制备的血影细胞与抗-D抗体标准品孵育后，上清液中的抗体效价在1∶16与1∶32之间。表1  标准抗体与血影细胞孵育后上清液的抗体效价（略）

　　2.3  IgG含量、抗-D抗体含量和回收率 

　　用30 mmol/L PB制备的血影细胞对血浆进行亲和层析得到的制剂中，IgG含量为（4.24±1.53）g/L（n=7），其中单体加二聚体占（99.9±0.25）％（n=7）；抗-D抗体的含量为（3.45±0.31）mg/L（n=7），回收率为（84.65±7.85）％（n=7）；7次重复得到的制剂均不含抗A、抗B血型抗体以及IgA、IgM和血红蛋白。          

　　2.4  分离纯化过程对血影细胞的影响 

　　用30 mmol/L PB制备的血影细胞在2%戊二醛固定后和亲和层析后细胞形态略变小，而经过洗脱液洗脱的血影细胞比固定后的细胞形体稍大，但细胞仍然呈完整圆形，细胞涂片光镜下未观察到细胞膜的碎片。见图1。

　　3  讨论
    　　
　　本课题组曾用柱层析法从低效价血浆中分离得到含抗-D抗体的IgG[6]，再用经2 ％戊二醛固定的RhD阳性红细胞从IgG中纯化抗-D抗体。
   
　　为提高抗-D抗体的回收率，设想直接用RhD阳性红细胞从含抗-D抗体的血浆中分离纯化该抗体。实验发现，戊二醛固定30 min的红细胞与血浆接触后出现血红蛋白溢出现象，延长红细胞固定时间和灭活血浆补体仍不能改善。鉴于RhD抗原仅位于红细胞膜上，Litten等[7，8]方法，利用低渗的裂解液将血红蛋白从红细胞中释放出来。结果表明，渗透浓度分别为40、30和20 mmol/L的PB均可使红细胞裂解而释出Hb，成为具有D抗原性的血影细胞。光镜下，用40和30 mmol/L的PB制备的血影细胞呈光滑圆形，未见细胞膜碎片；40 mmol/L PB制备的血影细胞在细胞中心仍有少许Hb，30 mmol/L PB制备的血影细胞内不含Hb。用20 mmol/L PB制备的部分血影细胞形态不规则，可见散在的膜碎片。抗原性检测显示，用40和30  mmol/L PB制备的血影细胞的抗原性明显强于用20 mmol/L PB制备的血影细胞。鉴于30 mmol/L PB制备的血影细胞保持了较强的抗原性并且不带有Hb，应用此血影细胞与含低效价抗-D抗体的血浆进行亲和层析，成功分离了抗-D抗体，抗-D抗体回收率提高到84.65%。同时制剂总 IgG量明显低于血浆中的含量，不含A、B血型抗体以及IgM、IgA和Hb。结果还表明，经过亲和层析，血影细胞的形态没有发生明显变化，提示有再利用的可能性。
    　　
　　因此，用30 mmol/L PB将遗传表型为CCDee的O型红细胞制备为具有完整D抗原性的血影细胞，以此作为固相抗原与血浆进行亲和层析，可以从低效价血浆中分离纯化抗-D抗体，操作步骤简单，抗-D抗体的回收率较高。

【参考】
  　　[1]Jabara S,Barnhart KT. Is Rh immune globulin need in early first?trimester abortion A review[J]. Am J Obstet Gynecol, 2003(3):623-627.

　　[2]Augustson BM, Fong EA, Grey DE, et al. Postpartum anti?D: can we safely reduce the dose[J].Med J Aust, 2006(12):611-613.

　　[3]Fung KF, Eason E, Crane J, et al. Prevention of Rh alloimmunization[J]. J Obstet Gynaecol Can, 2003(9):765-773.

　　[4]Ambriz?Fernandez R, Martinez?Murillo C, Quintana?Gonzalez S, et al.Fc recepteor blockade in patients with refractory chronic immune thrombocytopenic purpura with anti?D IgG[J]. Arch Med Res, 2002(6):536 -540.

　　[5]Kumar M, Vil TA, Johnson CS, et al. Treatment, outcome and cost of care in children with idiopathic thrombocytopenic purpura[J]. Am J Hematol, 2005(3):181-187.

　　[6]谢竞，石明隽，张国忠,等.抗D抗体的提取工艺研究[J].生化药物杂志，2005(4):208-210.

　　[7]Litten J, Culpepper R, Bakerman S. Studies on the characterization of the RhO(D) antigen[J]. Biochimica Biophysica Acta, 1978(2):226-234.

　　[8]Tan Y，Qiu Y，Xu H，et al. Decreased immunorejection in unmatched blood transfusions by attachment of methoxypolyethylene glycol on human red blood cells and the effect on D antigen[J]. Transfusion, 2006(12):2122-2127.