环维黄杨星D对Na2S2O4诱导EVC304细胞损伤的保护作用
作者：袁冬平, 许立, 龙军, 梁涛, 陶玲, 方泰惠
【摘要】 目的： 研究环维黄杨星D(CVB-D)对Na2S2O4诱导EVC304细胞损伤的保护作用。方法： 采用体外培养人脐静脉内皮细胞EVC304，Na2S2O4作为耗氧剂建立细胞缺氧损伤模型。用MTT法测定细胞存活率与细胞培养液乳酸脱氢酶（LDH）活力反映细胞损伤的程度，培养液一氧化氮合酶（NOS）活力与内皮素（ET）含量分析EVC304细胞的功能。结果： CVB-D能显著抑制Na2S2O4诱导EVC304细胞OD570的降低和细胞培养液中LDH活力的增加，提高培养液中NOS活性，降低ET的含量(与模型组比较，P<0.05或P<0.01)。结论： CVB-D对Na2S2O4诱导EVC304细胞损伤具有保护作用，其作用机制可能与改善NOS和ET失调有关。
【关键词】 环维黄杨星-D； 内皮，血管； 脐静脉； 乳酸脱氢酶； 内皮素；一氧化氮合酶
［Abstract］ Objective: To investigate the protective effects of cyclovirobuxine D （CVB-D）on human umbilical vein endothelial cell (EVC304) from the injury induced by Na2S2O4 in vitro. Methods: Cell injury model of cultured EVC304 was induced by Na2S2O4 as oxygen comsuming agent. Cell injury degree was determined with methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) stainning method.and lactate dehydrogenase (LDH) activity in culturing medium. Cellular function of EVC304 was indicated by nitric oxide syntyhase (NOS) activity and endothelin (ET) content in the medium. Results: Cell survival ratio and NOS activity significantly decreased after treated with Na2S2O4, and the LDH activity and ET concents significantly increased (P<0.05，P<0.01). CVB-D remarkablely attenuated EVC304 injury induced by Na2S2O4. Conclusions: CVB-D can protect ECV304 from injury induced by Na2S2O4. The protective mechanism may relate to ameliorating disturbance of NOS and ET of ECV304.
［Key words］ cyclovirobuxine D; endothelium,vascular; umbilical veins; lactate dehydrogenase; nitric-oxide syntyhase; endothelin
环维黄杨星D(Cyclovirobuxine D,CVB-D)，又称黄杨宁，是从黄杨木中提取的生物碱，属孕甾烷衍生物，分子式为C26H46N20。主要用于气滞血瘀所致的胸痹心痛、脉结代、冠心病、心律失常者。临床资料提示，CVB-D对多种心律失常、心绞痛、冠心病、心功能不全等心血管疾病具有良好的疗效[1，2]，但其对内皮细胞功能的影响未见报道，2006年8月与贵阳医学院药教研究室合作，以EVC304细胞为研究对象，观察CVB-D对耗氧剂Na2S2O4诱导EVC304损伤的影响，为VCB-D临床应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 人脐静脉内皮细胞株EVC304 购于中科院上海细胞库。
1.2 试剂与仪器
CVB-D购自南京小营制药厂，纯度>90%（HPLC）。尼膜同由德国拜耳公司生产，批号CANAL2。DMEM（LOW）是GIBCOBRL公司产品，小牛血清是杭州四季青生物工程材料研究所产品，胰蛋白酶是Sigma公司产品。乳酸脱氢酶（LDH-L）试剂盒，中生北控生物科技有限公司，批号为130021。一氧化氮合酶（NOS）试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号20050311。内皮素ET RIA KIT，解放军总科技开发中心放免所，批号06120。
1.3 细胞培养和实验处理[3]
ECV304细胞置于低糖完全DMEM培养液中，隔天换液，2~3 d传代1次，传3代后用于实验。当传代细胞生长良好时，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，1 500 r/min离心5 min，洗涤2次，以细胞数为1 ×105/ml接种于96孔板，100 μl/孔，在37℃、5%CO2培养箱中培养。待其生长至单层融合后，换无血清低糖DMEM同步生长24 h。 实验共分6组，对照组含10%小牛血清低糖完全DMEM培养液，模型组含10%小牛血清低糖完全DMEM培养液，Nim组含终浓度为1 nmol/L的Nim-低糖完全DMEM培养液；CVB-D 3组的终浓度分别为0.01 μmol/L、0.1 μmol/L和1 μmol/L CVB-D-低糖完全DMEM培养液。各组培养30 min后，除对照组外，其余各组均加入终浓度为1 mmol/L的Na2S2O4 20 μl作用2 h，吸去培养液，用D-Hank′s液洗2次，然后加入无血清的低糖完全DMEM 200 μl，继续培养24 h。
1.4 细胞存活率的测定
每孔加5 g/L MTT 20 μl，37 ℃孵育4 h，吸弃上清液，每孔加二甲基亚砜100 μl，振荡数分钟，用DG3022A型酶联免疫检测仪于570 nm测定细胞光密度OD值。并根据下列公式药物对Na2S2O4引起的内皮细胞损伤的抑制率：抑制率＝（OD给药组－OD模型组）/（OD对照组－OD模型组）×100%。
1.5 LDH、ET、NOS的测定
收集加MTT前的细胞培养液，参照试剂盒说明检测LDH、NOS,用放射免疫学的方法测定ET。
1.6 统计学分析
所有数据以（x±s）表示，用SPSS12.0统计软件包进行方差分析及t检验，P<0.05为有统计学差异，P<0.01为有显著性差异。
2 结果
2.1 OD570值和LDH活力
Na2S2O4作用于ECV304细胞后，模型组OD570值显著降低，培养液LDH活力显著增加，与对照组比较，差异显著。CVB-D 1 μmol/L和0.1 μmol/L剂量组的OD570值显著升高，与模型组比较，差异显著。Na2S2O4处理ECV304细胞后，培养液LDH活力显著增加，而CVB-D 1 μmol/L和0.1 μmol/L两个剂量组均能抑制Na2S2O4诱导的培养液中LDH活力的增加，提示CVB-D对Na2S2O4诱导的ECV304损伤具有一定的保护作用。见表1。表1 环维黄杨星D 对Na2S2O4所致ECV304细胞损伤的影响（略）注：与对照组比较(1)P<0.01；与模型组比较，(2)P<0.05,(3)P<0.01。
2.2 NOS和ET
NOS与ET是反映内皮细胞生物学功能的重要指标。实验结果提示，经Na2S2O4处理后，ECV304细胞培养液中NOS活力显著降低，ET含量明显升高，提示内皮细胞损伤。1 μmol/L和0.1 μmol/L两个剂量的CVB-D能显著抑制Na2S2O4诱导的ECV304细胞ET释放，提高NOS的活性（与模型组比较,P<0.05或P<0.01）。见表2。表2 环维黄杨星D 对Na2S2O4所致ECV304细胞NOS和ET的影响（略）注：与对照组比较，(1)P<0.01；与模型组比较，(2)P<0.05, (3)P<0.01。
3 讨论
血管内皮在缺血再灌注损伤中起重要作用[4]。血管内皮细胞作为重要的内分泌细胞，可分泌多种血管活性物质，主要可分为两大类：一类是内皮源性舒张因子(EDRF)，主要包括NO等；另一类是内皮源性血管收缩因子(EDCF)，主要有ET[5]。正常生理情况下，EDRF和EDCF的平衡在保持正常血管张力、维持血管内皮的功能、维持器官的灌流、修复损伤及解除血管痉挛中起着重要的作用[6]。因此，阻抑NO与ET合成和释放的异常，对防止心血管疾病的发生具有积极作用。
CVB-D临床用于多种心血管疾病[2]，具有抗缺血再灌注损伤的作用[7]。本实验采用LDH释放和MTT比色法反映CVB-D对耗氧剂Na2S2O4诱导ECV304细胞损伤的保护作用。实验结果提示，CVB-D能够保护缺血的内皮细胞。Na2S2O4作用于ECV304细胞后，培养液中ET水平显著增加而NOS活力降低，表明血管内皮功能紊乱；而CVB-D可减少ET释放，增加与NOS活力，对缺氧损伤导致的内皮细胞功能失调有保护作用。这对于CVB-D在临床的应用是有指导意义的。
综上所述，CVB-D对耗氧剂Na2S2O4诱导ECV304损伤具有显著的保护作用，关于其保护内皮的分子生物学机制有待进一步研究。
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