家蝇相关序列扩增多态性扩增体系的建立与优化

                  作者：刘红美, 方小波, 郑勤妮, 胡仕明, 吴建伟

【摘要】  　　目的： 建立和优化家蝇的相关序列扩增多态性（SRAP-PCR）扩增体系。方法: 以驯养家蝇为材料,通过单因子实验分别研究了模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物浓度及Taq DNA聚合酶用量对家蝇SRAP分子标记扩增体系的影响,并对扩增体系进行了优化。结果: 优化后的反应体系总体积为30 μl,含50 ng模板DNA、1.5 mmol/ L Mg2+、0. 20 mmol/ L dNTPs、0. 15 μmol/ L 引物和0. 50 U Taq DNA聚合酶。结论: 家蝇SRAP-PCR扩增优化系统的建立,为今后利用SRAP 技术进行家蝇遗传多样性分析、基因定位奠定了基础。

【关键词】  蝇科; 随机扩增多态DNA技术； 遗传标记

　　［Abstract］Objective: To establish and optimize SRAP-PCR reaction system of housefly. Methods: Effects of concentrations of template DNA, Mg2+, dNTPs, primers and amount of Taq DNA polymerase on SRAP molecular marker amplification system of Musca domestica L were studied in monofactorial experiment, and the amplification system was optimized. Results: Total volume of the optimal system was 30μl containing 50 ng of template DNA, 1.5mmol/ L of Mg2+, 0. 20 mmol/ L of dNTPs, 0. 15μmol/ L of primers and 0. 50 U of Taq DNA polymerase. Conclusion: This system provides a useful tool for analysis of genetic diversity and gene location of Musca domestica L.

　　［Key words］ Muscidae; random amplified polymorphic DNA technique; genetic markers

    家蝇( Musca domestica L )是重要的医学媒介昆虫,能传播痢疾、伤寒、霍乱、脊髓灰质炎等多种疾病。近年来,随着家蝇体内抗菌肽的发现,家蝇在原料、医药保健和界物质能量循环等方面具有重要的应用价值。由于对家蝇的偏见,国内外从分子水平研究家蝇的报道还比较少,并且都只限于RAPD技术的利用[1]。相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism,SRAP) 是一种基于PCR原理的新型DNA 分子标记技术,其技术的核心是PCR扩增,影响PCR扩增的因素都将影响到SRAP的成败。因此,对Taq 酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物这5个因子进行优化,建立适合家蝇DNA的SRAP-PCR 扩增体系,为SRAP系统在家蝇乃至昆虫中的研究鉴定基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  供试材料 

　　驯化家蝇由贵阳医学院寄生虫学教研室2000年建立种群,并在实验室进行多代种群繁殖。幼虫以麦麸、蛆浆、面粉和水混合物为饲料,饲养温度（25℃±1）℃,相对湿度为50%～60%,光照12 h。实验时选用肥大的3龄幼虫作为材料。

　　1.1.2  仪器、试剂 

　　实验用PCR扩增仪为Eppendorf 5331梯度PCR仪; 10 ×PCR buffer、MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶、琼脂糖和DL2000(Marker)等均购自大连Takara (宝生物)工程有限公司。SRAP引物由上海鼎安生物科技有限公司合成,引物名称及序列见表1。表1  SRAP引物及序列（略）

　　1.2  方法

　　1.2.1  家蝇基因组DNA的提取 

　　采用徐书华等[2]人的方法，提取家蝇3龄幼虫基因组DNA,DNA 经紫外分光光度计和0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测和定量,将纯度好、杂质少的样品于-20 ℃保存用于PCR扩增。

　　1.2.2  PCR 体系、程序及检测 

　　参照Li 等[3]的扩增反应体系。标准PCR反应体系中模板DNA 100 ng,dNTPs 0.2 mmol/L,上下游引物0.2 μmol/L,1.5 mmol/L MgCl2, 1U Taq酶,总体积为30 μl。扩增程序采用复性变温法：开始95 ℃变性2min,反应前5个循环在94 ℃ 1 min,35 ℃1 min,72 ℃ 2 min条件下运行；之后35个循环为94 ℃ 1 min,50 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min；最后72 ℃延伸7 min。2%琼脂糖凝胶电泳检测,电极缓冲液采用0.5×TBE,稳电压80 V,30 min。溴化乙锭染色,凝胶成像系统观察并拍照。

　　1.2.3  SRAP引物筛选 

　　用1.2.2项下获得的SRAP-PCR 扩增体系和扩增程序进行表1中正向引物间的组合、反向引物间组合和正反向引物组合的筛选,将扩增效果好、条带多、重复性好的引物组合用于扩增体系的优化。

　　1.2.4  SRAP-PCR 扩增反应体系的优化 

　　以家蝇基因组DNA 为模板,对SRAP-PCR 扩增反应5大影响因子进行5 水平单因素梯度设置,见表2。表2  家蝇SRAP-PCR扩增反应各影响因子的梯度设置（略）

　　2  结果
　　
　　2.1  SRAP引物筛选　　

　　为检测所设计引物（表1）的质量和对雌、雄家蝇基因组DNA的扩增效果,将表1的5个正向引物、6个反向引物进行组间与组内的引物组合进行筛选,用琼脂糖凝胶电泳检测各引物组合的扩增效果（见图1）。表3为扩增效果好的引物组合。实验共筛选21对扩增效果好的引物组合。正向引物组合扩增效果好的有3对，6个反向引物组合扩增效果好的有9对，其余9对为正向引物与反向引物间的组合。结果显示,所设计的SRAP引物不但可以正向和反向引物间配对组合,而且正向引物间、反向引物间也可以组合配对进行PCR 扩增。

　　2.2  家蝇模板DNA 浓度优化PCR扩增反应中,模板量的过多或过少都将影响扩增的效率。模板ＤＮＡ量过少时,扩增效率低,模板和引物不能有效配对,无扩增带或扩增带较少；当ＤＮＡ量过多时,出现弥散状背景而且无扩增产物。由图1可见,模板ＤＮＡ 10~200 ng时均有扩增条带,说明SRAP-PCR体系对模板ＤＮＡ量的多少要求不高。当模板DNA 加入量为10 ng 时,扩增条带很微弱,在100 ng 以上时又开始出现弥散状背景。模板DNA量为50 ng 时效果最好，见图2。
 
　　2.3  Mg2+浓度Mg2+浓度不仅影响酶活性,而且影响引物的退火、模板和中间产物的解离温度、产物的特异性、引物二聚体的形成等,因此Mg2+的浓度对ＰＣＲ扩增反应有着显著影响。浓度过低,无扩增产物; 浓度过高时,易产生非特异扩增,出现弥散状背景。Mg2+浓度在1.5 mmol/L扩增效果（亮度和丰度）较其它浓度好，见图3。
表3  家蝇SRAP引物筛选结果（略）

　　2.4  Taq 酶浓度Taq DNA 聚合酶在PCR 中的用量受反应体积、酶活性、酶耐热性等因素的影响。Taq 酶用量少易导致PCR反应效率下降,造成扩增产物较少。而使用较高浓度的Taq 酶易导致非特异性的扩增,出现弥散状背景,不见扩增条带，还造成药品浪费,增加成本。由图4可见,在30 μl的反应体系中,Taq 酶的用量最好是0.5~1.0 U,　超过1.5 U,就会出现弥散状背景,不见扩增条带。所以从方面考虑,30 μl反应体系中Taq酶适宜用量为0. 5 U。

　　2.5  dNTPs 浓度dNTPs 是PCR 扩增反应的原料,必须达到一定浓度才能满足PCR 扩增需求。若dNTPs 浓度过低,会影响反应效率,甚至会因dNTPs 过早的消耗而使PCR 扩增产物单链化,影响PCR 扩增的效果;但过高也会与Taq DNA 聚合酶竞争Mg2+,导致聚合酶错误的掺入,同样也不利于PCR 扩增。由图5可见,不同浓度dNTPs 扩增结果差异很大。在0.05~0.10mmol/ L时扩增产物谱带很弱,在0.15 和0.20mmol/ L 时扩增效果较好,在0.30 mmol/L未见扩增条带。从扩增亮度考虑,dNTPs 的浓度确定为0.20mmol/ L。

　　2.6  引物浓度引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1~0.5μmol/L。引物量太低,则产物量降低,甚至没有扩增产物；引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成,还会增加引物二聚体的形成。非特异产物和引物二聚体也是PCR反应的底物,与靶序列竞争DNA聚合酶及dNTP底物,从而使靶序列的扩增量降低。从图6 可见,引物浓度为0. 15 μmol/L 和0.25 μmol/L时,扩增产物电泳谱带清晰稳定，考虑到药品用量以及引物量过大易形成引物二聚体,所以确定引物浓度为0. 15 μmol/L。

　　3  讨论　　

　　SRAP 标记是在已有的DNA 分子标记优缺点的基础上开发的一种新的基于PCR 的DNA 分子标记技术。SRAP 标记克服了随机扩增多态DNA（RAPD）重复性、稳定性差的缺点；不需要像限制性片段长度多态性（RFLP）标记那样要求高纯度和高浓度的DNA和使用放射性同位素, 也不需像扩增片断长度多态性（AFLP）那样需要预扩增和连接等烦琐的操作,从而减少了对人力、物力的需求和依赖。重要的是,通过SRAP 具有简单、高效、高共显性、重复性好、易测序等优点,尤其它可以检测基因的可译读码框(ORFs) 区域,从而提高了扩增结果与表现型的相关性[4]。目前,DNA分子标记技术应用于家蝇的主要是RAPD，本实验将SRAP 技术应用到家蝇的研究中,为在分子领域研究家蝇遗传变异提供了可能性。 实验证明，使用高浓度的琼脂糖凝胶电泳也可以较好的分辨出多态性条带,避免了使用繁琐的聚丙烯酰胺胶电泳来检测PCR 产物。实验发现酶浓度和Mg2+对SRAP-PCR 扩增结果影响较大,微小的变动就能引起很大的变化，与关桦楠等[5]人的研究结果不同的是该体系对模板浓度的要求不高,因此有必要针对不同的物种来进行SRAP-PCR 扩增体系的优化。引物、dNTPs 浓度的变动对体系影响相对较小,体系中各组分的浓度还可根据具体的实验情况进行调整。实验结果提示,家蝇SRAP-PCR 适宜的反应体系为：在30 μl反应体系中含50 ng模板DNA、1.5 mmol/L Mg2+、0.20 mmol/L  dNTPs、0.15 μmol/L 引物和0.50 U Taq DNA聚合酶。

【】
  　　[1]王亚超, 白林, 侯蓉. 分子标记技术在蝇类研究中的应用[J]. 四川动物,2006(3): 658-661.

　　[2]徐书华,曾庆韬. 果蝇基因组DNA 的大规模提取及其RAPD - PCR反应条件的优化[J]. 湖北大学学报(版), 2002(4):342-346.

　　[3]Li G, Quiros C F. Sequence-related amp lified polymorphism( SRAP) , a new marker system based on a simp le PCR reaction: its app lication to mapp ing and gene tagging in B rassica [J]. Theor App l Genet, 2001(103):455-461.

　　[4]Li G,Quiros C F．Analysis,expression and molecular character-ization of BoGSL-ELONG,a major gene involved in the aliphatic glucosinolate pathway of brassice species[J]. Genetics,2002(162)：1937-1943．

　　[5]关桦楠,迟德富, 宇佳，等. 利用正交设计优化异色瓢虫SRAP-PCR反应体系[J].昆虫知识,2008(1):156-161.