灭蚊真菌贵阳腐霉基因组文库的构建

【摘要】  目的： 建立贵阳腐霉（Pythium guiyangense Su）基因组文库以便克隆该真菌的基因特别是与灭蚊毒力有关的基因。方法: 用限制性内切酶Sau3AI消化贵阳腐霉基因组DNA，同时用限制性内切酶BamHI消化质粒pBluescript SK(-)，再将其去磷酸化；将基因组的酶切产物连接到载体上，再转化大肠杆菌DH5α。 结果: 所建贵阳腐霉的基因组文库共包含11 520个克隆。经蓝白斑筛选、PCR验证以及双酶切验证，文库平均插入片段长度为1.2 kb，覆盖率约为贵阳腐霉基因组的3倍。结论: 建立了贵阳腐霉的基因组文库，可以从中克隆与贵阳腐霉灭蚊毒力有关的基因。

【关键词】  真菌； 灭蚊； DNA限制酶类； 贵阳腐霉； 基因组文库

    ［Abstract］ Objective: To construct a genomic library of Pythium guiyangense Su, strain 1938 GY.  Methods: The digested genomic DNA with Sau3AI was inserted into pBluescript SK(-) plasmid which was digested with BamHI and treated with calf intestinal alkaline phosphatase . Next, the recombinant plasmids were transferred into E.coli DH5α. Results: A genomic DNA library was constructed which included 11520 clones with average insert sizes about 1.2 kb. Conlusions: The results of this experiment provide a source for screening genes of P.guiyangense ,and lay basis for further work of genetic engineering of this fungus.

    ［Key words］ fungi; mosquito control; DNA restriction enzymes; Pythium guiyangense Su; genomic DNA library

    贵阳腐霉（Pythium guiyangense Su）是苏晓庆教授于1994年在贵阳医学院土壤中分离得到的一株新的灭蚊真菌，属卵菌纲、霜霉目、腐霉科、腐霉属。实验证明，几丁质酶在真菌侵染昆虫的过程中发挥着十分重要的作用［1，2］。2003-2005年，对几丁质类似物诱导后的贵阳腐霉悬液中的胞外蛋白酶进行检测，成功地检测到几丁质酶活性，并初步克隆了疑似该酶基因的DNA片段。为了在此片段的基础上获得贵阳腐霉几丁质酶的全长基因以及其他与灭蚊毒力有关的基因，以便用于贵阳腐霉的基因工程改良，因此，构建了贵阳腐霉的基因组文库。现报道如下。

    1  材料与方法

    1.1  材料 

    1.1.1  菌种与质粒  真菌：贵阳腐霉（strain GY 1938）是1994年在贵阳医学院土壤中分离的高效灭蚊真菌，经纯化接种于SFE和KPYG2琼脂平板上，常规保种、传代，培养温度为（25±1）℃。

    　　大肠杆菌E.coli DH5α由本实验室保存于-70 ℃。质粒pBluescript SK(-)是一种Cloning vector，具有氨苄青霉素抗性, 购自上海生工公司。

    1.1.2  试剂  限制性内切酶BamHI、Sau3AI、氨苄青霉素（Ampicillin）、T4DNA连接酶为TAKARA公司产品，Taq DNA聚合酶、dNTP、溴化乙锭（EB）为SABC公司产品，RNA酶、牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）、X-gal及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷酶（IPTG）为Promega公司产品，其余均为进口或国产分析纯试剂。

    1.1.3  培养基  KPYG2培养基：蛋白胨1.5 g/L, 酵母浸出膏0.5 g/L, 葡萄糖3.0 g/L, 胆固醇25 mg/L, 氯化钙110 mg/L, 玉米油10 g/L［3］。SFE培养基 ：将100 g葵花子粉碎，浸泡于1 000 ml蒸馏水中，6层纱布过滤，再加1 000 ml蒸馏水，分装贮存于-20 ℃，临用时取出解冻，用蒸馏水稀释1倍，高压蒸汽灭菌30 min［3］。LB培养基 ：蛋白胨10 g/L, 酵母浸出膏5 g/L, 氯化钠10 g/L (pH7.0)［4］。基因组文库保存培养基［5］：1/10保存液1（K2HPO4360 mol/L、KH2PO4132 mol/L、C6H8O7·H2O17 mol/L、Glycerol 44%）, 1/100保存液2(MgSO444 mol/L 、(NH4)2SO4 680 mol/L )，50 mg/L Amp，液体LB培养基补足100 ml。

    1.2  方法

    1.2.1  基因组DNA的提取  采用氯化苄法提取贵阳腐霉基因组DNA，将菌丝研磨后加氯化苄等不断混匀，经离心、抽提及RNA酶消化，置-20 ℃备用。用紫外分光光度计测定基因组DNA浓度，并用琼脂糖凝胶电泳测定其纯度［6］。

    1.2.2  贵阳腐霉基因组DNA的纯化  采用北京华美生物公司的DNA纯化试剂盒进行纯化，按其说明书操作步骤进行。

    1.2.3  贵阳腐霉基因组DNA的部分酶切及目的片段的回收  用限制性内切酶Sau3AI消化贵阳腐霉基因组DNA产生5’-GATC突出末端，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后-20 ℃保存备用［7］。

    1.2.4  质粒pBluescript SK(-)的提取、限制性内切酶酶切和去磷酸化  用质粒小量制备试剂盒抽提质粒pBluescript SK(-)，将其用限制性内切酶BamHI进行消化，产生5’-GATC突出末端，用CIAP使消化后的质粒DNA脱磷酸化，产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后-20 ℃保存备用［8］。

    1.2.5  构建文库  将处理后的DNA片段与载体连接，并转化到大肠杆菌进行蓝白斑初筛。

    1.2.6  文库质量的检测及保存  对可能的阳性克隆进行PCR验证及双酶切验证，最后保存在加有基因组文库保存液的96孔细胞培养板中。

    2  结果

    2.1  贵阳腐霉基因组DNA的部分酶切

    用限制性内切酶Sau 3AI 在37 ℃作用5 min部分酶切基因组DNA，大部分酶切产物集中在500～3 000 bp。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1。

    2.2  质粒pBluescript SK(-)的酶切和去磷酸化

    用限制性内切酶BamHI消化pBluescript SK(-)质粒DNA，然后用CIAP进行处理，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测（见图2）。

　　2.3  文库的构建、检测及保存

    经过连接、转化等过程将文库构建好后，保存在4块96孔板中，每孔30个菌落，克隆数达到约11 520个克隆。经过阳性克隆的PCR验证及双酶切验证，扩增产物为500～2 500 bp，集中于1 000～1 500 bp。为了确定文库中插入片段大小的分布情况，将随机挑取的30个克隆按插入片段大小进行分组（如图3），从图中可以看出：该文库插入片段大小分布在500～2 500 bp，平均长度为1 200 bp。

　　3  讨论

    为了获得已知片段的旁侧序列，构建一个基因组文库，然后利用已知序列从中筛选出完整的基因序列是一种较为常用的方法。也就是说，我们可以在所建立的贵阳腐霉基因组文库的基础上，根据已知片段筛选出其几丁质酶基因的全长。另外，基因组文库还可用于大规模基因组测序、物理图谱的构建及制作基因组芯片等。因此，构建一个基因组文库对多项研究都有着十分重要的意义。

    由完全随机片段组成的基因组文库的大小，必须保证能够足以代表基因组中任何一个特定基因序列，它取决于克隆片段的大小和基因组的大小。要以概率P从文库中分离出某一特定序列所必须筛选的克隆数N，可通过函数式表示：

    N=ln( 1-P )/ln( 1-f)

    其中，N为所需重组质粒数，P为任何一段DNA序列出现的概率，f为插入片段的平均长度与基因组总长度之比［7，8］。

    　　贵阳腐霉基因组的大小尚未确定，但腐霉基因组的大小平均在1 000 kb。本实验中插入片段平均长度在1.2 kb左右。因此，要以99％的概率（P ）筛选到基因组任意一个基因，则需要重组质粒数（N）为3 838。一般来说，为了以较大的几率筛选出目的基因，一个基因组文库必须含有3～10倍于最低重组体克隆数的克隆。本研究所构建文库的覆盖倍数约为3倍，基本达到构建基因组文库的要求。当然，如果覆盖倍数能够达到10倍，从理论上来说，可以提高筛选出目的片段的可能性。

    　　可以在下一步的工作中用获得的疑似贵阳腐霉几丁质酶基因的片段在目前所建立的基因组文库中去筛选出其完整的基因序列，并进行表达验证。同时，本文库为进一步克隆贵阳腐霉的其他与灭蚊毒力有关的基因创造了条件，而这些基因对于贵阳腐霉的基因工程改良具有重要价值。

【】
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