阿魏酸钠对高糖诱导下原代系膜细胞增殖的影响

                      作者：石明隽 罗化 肖瑛 郭兵 张国忠

【摘要】  目的： 探讨阿魏酸钠（SF）对高糖诱导下原代肾小球系膜细胞（GMC）增殖的作用及其机制。方法： 原代培养肾小球系膜细胞，分为正常组、甘露醇组、高糖组、高糖加不同浓度SF组，分别于处理后24 h、48 h收集细胞。用4-甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖；免疫细胞化学检测p53和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）的表达。结果： 48 h内，高糖促进GMC增殖并上调p38MAPK蛋白的表达，抑制p53的表达，SF能明显对抗高糖的这种作用，其作用随SF浓度的增加、作用时间的延长而加强。结论： SF可能是通过抑制p38MAPK通路，促进p53的合成，从而抑制高糖诱导的GMC增殖。

【关键词】  糖尿病肾病； 蛋白质p53； 蛋白激酶类； 肾小球系膜细胞； 阿魏酸钠； p38丝裂原活化蛋白激酶

    ［Abstract］ Objective: To investigated the effects and mechanism of sodium ferulate (SF) on the proliferation of mesangial cells induced by high glucose. Methods: The primary glomerular mesangial cells were divided into normal gloucose group, mannitol group, high gloucose group and high gloucose group plus different concentration of SF groups. Cells were collected at 24 h and 48 h of cultivation. Cell proliferation was measured by MTT assay. Expression of p53 and p38MAPK proteins was detected with immunocytochemistry method. Results: High glucose significantly promoted mesangial cell proliferation, up-regulated p38MAPK protein expression, and down-regulated p53 expression within 48 h. These effects were inhibited by SF in a concentration-dependent manner. Conclusion: SF can inhibit proliferation of mesangial cells induced by high glucose possibly through suppressing the pathway of p38MAPK and increasing the levels of p53.

    ［Key words］ diabetic nephropathies; protein p53; protein kinases; glomerular mesangial cells; sodium ferulate; p38 mitogen activated protein kinase

    糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）的发病机制较复杂，至今尚未完全明了，但长期的高血糖是引起DN的始动因素和中心环节［1］。肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cells，GMC）为肾小球固有细胞，有实验证实高糖可刺激其活化，进而产生收缩、增生，合成并分泌多种炎症介质和基质成分，促进肾小球硬化［2，3］。阿魏酸钠(sodium ferulate,SF)是我国自行研制开发的新的非肽类内皮素拮抗剂，临床上可用于慢性肾小球肾炎、肾病综合征和DN等疾病。2006年9月~2007年4月用原代培养GMC，观察SF对高糖环境中GMC增殖的作用及对p53和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase, p38MAPK)表达的影响，探讨SF对高糖诱导下GMC增殖的可能作用，为进一步阐明SF改善DN的作用机理，提供新的实验依据。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  主要试剂  SF（吉林西点药业科技股份有限公司）；甘露醇（石家庄四药有限公司）；MEM培养基（美国Gibco公司）；L-谷氨酰胺、4-甲基偶氮唑蓝(MTT) 、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶（美国Sigma公司）；胎牛血清(FCS，hyclone）；p53抗体、p38MAPK抗体、SABC试剂盒（武汉博士德生物有限公司）。

    1.1.2  主要仪器设备  CO2孵箱（美国REVCO公司；倒置显微镜(IX70)；酶标仪(美国BIO-RAD公司)；CM-2000B型生物医学图像分析系统(北京航空航天大学)。

    1.2  方法

    1.2.1  大鼠原代肾小球系膜细胞培养  雄性SD大鼠，体重180~200 g，贵阳医学院实验动物中心提供。大鼠双肾灌洗后，筛网滤过分离肾小球，并用Ⅳ型胶原酶消化处理，种植法体外培养大鼠肾小球系膜细胞。培养细胞经鉴定为系膜细胞［4］。取3～8代用于实验。

    1.2.2  实验分组  正常组（5.5 mmol/L D-葡萄糖）；SF加正常剂量糖培养组（SF240 mmol/L+5.5 mmol/L D-葡萄糖）；甘露醇（5.5 mmol/L D-葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇)；高糖组（30 mmol/L D-葡萄糖）；SF加高糖培养组（SF60、120、240 mmol/L+ 30 mmol/L D-葡萄糖）。各组分别于培养24 h和48 h时收集细胞用于检测。

    1.2.3  MTT法检测系膜细胞增殖  将GMC分组，每组3复孔，细胞接种数为2 000个/孔。镜下观察细胞全部贴壁均匀生长至亚融合时，换用无血清培养基24 h使细胞周期同步后，再用药物作用20 h和44 h，每孔加入MTT（5 g/L)20 μl，继续作用4 h，弃上清液，然后每孔加入DMSO 200 μl，轻微振荡30 min，酶标仪570 nm处测光吸收值(A)，实验重复2次。细胞增殖率公式为：（实验组OD值-对照组OD值）/对照组OD值。用苔盼蓝染色，检测细胞毒性。

    1.2.4  免疫细胞化学法检测p53和p38MAPK蛋白表达  预先在12孔板中加入无菌玻片，向每孔中加入1 m1浓度为1×105/m1的GMC，待细胞周期同步后，药物作用24 h和48 h，收集爬片细胞，95%乙醇37 ℃固定，山羊血清封闭，分别滴加p53和p38MAPK(1∶50) 50 μl于细胞爬片上，再加生物素化羊抗兔IgG，DAB显色，生物医学图像分析系统分析阳性表达的平均灰度值。

    1.2.5  统计方法  全部数据采用SPSS10.0统计软件包进行分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用q检验，相关系数检验用pearson法，检验水准以P<0.05为差异有显著意义。

    2  结果

    2.1  高糖和不同浓度SF对GMC增殖的影响

    作用48 h内，高糖明显刺激GMC增殖（P<0.01），增殖率达78.7％，而甘露醇组未见明显细胞增殖。不同剂量的SF组经台盼蓝染色证实活细胞数在96%以上；SF作用24 h即明显表现出抑制高糖诱导的GMC过度增殖作用；48 h时各SF组GMC的增殖显著低于同时点高糖组，而240 mmol/L浓度SF对正常培养的GMC无明显作用（见表1）。

    2.2  高糖和不同浓度SF对GMC表达p53和p38MAPK的影响 表1  不同浓度的阿魏酸钠对高糖诱导下GMC增殖的影响 (1)与相同处理时间正常组比较，P<0.01 ；(2)与相同处理时间高糖组比较，P<0.01；(3)与相同处理时间SF240 mmol/L加高糖组比较，P<0.01

    　免疫细胞化学显示，正常组和甘露醇组，p53和p38MAPK都有表达，主要在胞浆内靠近核周；高糖作用24 h，p53的表达受到抑制（P<0.01），而p38MAPK的表达显著上调（P<0.01），p38MAPK开始在细胞核内表达，在胞浆内也持续高表达。48 h时，p53表达下降，在细胞核内表达不明显，而p38MAPK在胞浆内表达量仍维持在高水平，在胞核内染色加深（P<0.01）。不同浓度的SF作用24 h则可显著下调p38MAPK，p38MAPK在细胞核和胞浆的阳性信号强度明显低于同时点的高糖组并促进p53的表达，p53在细胞核内和胞浆内的阳性信号强度显著高于同时点的高糖组，且这种作用随时间和SF浓度增加而增强(P<0.01)，呈剂量依赖关系。甘露醇也可上调p38MAPK的表达(P< 0.01)，但这种作用明显弱于高糖；对p53的表达则无明显影响(P﹥0.05）。见表2、图1。表2  不同浓度阿魏酸钠对高糖诱导下GMC表达p53和p38MAPK的灰度值(1)与相同处理时间正常组比较，P<0.01 ；(2)与相同处理时间高糖组比较，P<0.01；(3)与相同处理时间SF60 mmol/L组比较，P<0.01；与相同SF浓度24 h组比较P<0.01 注：箭头所指是阳性细胞 图1  免疫细胞化学显示不同浓度阿魏酸钠对p38MAPK表达影响

    2.3  p38MAPK与p53相关分析

    24 h和48 h高糖组与SF各组p38MAPK蛋白与p53表达呈高度负相关，相关系数为-0.890 0和-0.920 0，P<0.01。

    3  讨论

    　　GMC增殖、肥大和系膜区细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的沉积是DN肾小球早期的病理改变，并最终导致肾小球硬化。本研究结果显示，高糖诱导GMC过度增殖。从MTT的结果可以看出，高糖诱导24 h后，同正常组相比，GMC显著增殖，增殖率达到78.7％，到48 h时仍保持高水平，增殖率为71.4％，略低于24 h时，提示高糖诱导GMC增殖可能有一定的时间限度。甘露醇组细胞增殖未见明显变化。这就说明，GMC增殖是由高糖刺激引起，与渗透压关系不大。我们还发现，不同浓度SF均可显著抑制高糖促GMC增殖作用。同时，SF240 mmol/L加正常细胞组台盼蓝染色证实活细胞数在96%以上，说明该浓度的SF对GMC无明显的细胞毒性。

    　　MAPK信号通路是细胞内重要的信号系统，p38MAPK是MAPK家族主要的成员之一，参与细胞生长、增殖和分化。有研究表明高糖作为DN的主要致病因素可通过蛋白质非酶糖基化、多元醇通路、二酰基甘油-PKC通路以及氧化应激等多个环节导致p38MAPK激活，从非磷酸化状态转变为磷酸化状态，进而促进下游底物的磷酸化来实现信号传递，刺激GMC的活化、增殖，使GMC产生ECM增多［5，6］。研究显示，正常糖培养时p38MAPK在胞浆有表达，高糖作用24 h及48 h后，p38MAPK在胞浆内持续表达，而在细胞核内表达则随时间延长而明显增多，表明高糖作用可使p38MAPK激活，并向细胞核转移，可能参与基因转录的调节。

    　　p53是细胞周期的负调控因子，有研究表明，p53蛋白可通过诱导其下游靶基因p21的表达，抑制CyclinD1-CDK4/ 6复合物活性，从而抑制细胞分裂，并且还可诱导生长抑制和DNA损伤诱导家族45（growth arrest and DNA damage inducible45,GADD45）合成，GADD45与增殖细胞核抗原结合，抑制细胞进入S期。免疫细胞化学结果显示，在高糖刺激下p53表达减少，提示高糖可能通过抑制p53的表达加速细胞周期，促进GMC增殖。

    传统认为p38MAPK主要参与调控细胞应激反应和免疫反应，近年来发现它还参与调控细胞的增殖、凋亡和分化，其对细胞增殖的调控因细胞类型和所受的应激刺激类型而异［7］。实验结果显示，高糖刺激时p38MAPK激活，p53表达减少，系膜细胞增殖；应用不同剂量的SF后，p38MAPK在细胞核内的阳性信号强度明显低于同时点的高糖对照组，提示SF对p38MAPK的抑制作用可能发生在胞核内。有研究认为，p53可能是p38MAPK的下游产物［8］。而本实验显示，48 h高糖组与SF各组p38MAPK蛋白与p53表达呈高度负相关，相关系数为-0.9200，P<0.01。因此推测SF抑制高糖刺激下原代培养的系膜细胞增殖可能是通过抑制p38MAPK通路而促进p53的生成来实现的。

【】
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