免疫介导的再生障碍性贫血小鼠模型胸腺T?bet的表达水平及其意义

【摘要】  目的：探讨再生障碍性贫血(AA)小鼠模型中T?bet蛋白在胸腺的表达水平和意义。方法：建立免疫介导的骨髓衰竭模型，用免疫组织化学方法检测AA胸腺组织石蜡切片中T?bet蛋白表达水平。结果：模型小鼠组胸腺组织石蜡切片中T?bet蛋白表达水平(1.06＋0.18)％明显高于正常小鼠组(0.41±0.05)％(P＜0.01)；模型小鼠组胸腺T?bet蛋白表达与网织红细胞相对值(RC)及中性粒细胞绝对值(ANC)呈负相关(r值分别为－0.679和－0.701，P＜0.05)，而与血小板数及血红蛋白无明显的线性相关关系。结论：在免疫介导的骨髓衰竭模型小鼠中转录因子T?bet蛋白在胸腺表达增加，说明在AA发病机制中T?bet可能起一定作用。

【关键词】  再生障碍性贫血 小鼠模型 胸腺 T?bet

    Abstract  Objective：To study the expression and significance of T?bet in thymus of Immune?mediated aplastic anemia(AA)mice.Methods：Immune?mediated AA mice were developed，expression of T?bet protein in thymus of AA bone marrow was measured by immunohistochemistry.Results：Expression of T?bet protein in thymus from AA mice were(1.06±0.18)％，the nomaal controls were(0.41±0.05)％，AA group was significantly higher than normal controls(P＜0.01)，T?bet expression in thymus were negatively correlated with their RC and ANC.Conclusion：Trdnscription factor T?bet in Immune?mediated aplastic anemia mice was high，which suggests T?bet maybe participate in hematopoietic failure of AA.

    Key words  aplastic anemia；mice naodel；thymus；transcription factor；T?bet

    再生障碍性贫血(AA)主要表现为骨髓造血功能低下、全血细胞减少和贫血、出血、感染综合征［1］。其发病机制目前不清楚，众多研究表明，细胞免疫异常是获得性AA发病机制中的主要环节［2］。AA的细胞免疫异常主要表现为Thl淋巴细胞数目增多和功能亢进。T?bet是2000年Szabo等［3］发现了的一种新的在CD4＋Th1细胞的分化中起重要作用的属于T?box家族的转录因子，是Thl细胞特异性转录因子。本文拟通过建立免疫介导的骨髓衰竭小鼠模型，观察模型小鼠的T?bet蛋自在胸腺中的表达水平，以及其与中性粒细胞绝对值(ANC)、网织红细胞相对值、血小板数及血红蛋白的相关关系，了解T?bet蛋白在再障中的表达水平及与再障病情的相关性，为探讨再障的发病机制提供一些思路、线索。

    1  资料与方法

    1.1  实验动物与分组

    近交系DBＡ/2小鼠，10周龄，雄性，16～20 g，2只，由北京维通利华公司提供。近交系BALB/c小鼠(H?2d，MLSb)(H?2b，MLSb指小鼠的遗传型)，20只，8周龄，雌雄各半，由辐射防护研究院提供。将BALB/c小鼠随机分为正常对照组和骨髓衰竭模型组，各10只。

    1.2  试剂与仪器

    SK?1250、M?MuLV逆转录酶均购自立陶宛Fermentas公司。SP法试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。T?bet单抗购于Santa Cruz Biotechnology。DAB显色剂购于中国医学院生物工程研究所。

    1.3  小鼠免疫介导骨髓衰竭模型

    将DBA/2小鼠(供鼠)颈椎脱臼法处死，常规消毒后，立即在超净工作台中无菌取出胸腺和淋巴结，剪碎，加少量PBS液，轻轻研磨后小筛网过滤，制成单个细胞悬液。台盼蓝鉴定细胞活性，活性细胞在95％以上。细胞计数并配制成所需浓度5×106/mL备用。AA造模参照目前常用免疫介导再障小鼠模型［4］：BALB/c小鼠，经5.5 Gy 60 Coy射线全身一次性亚致死剂量均匀照射后，4 h内经尾静脉输入DBA/2小鼠的胸腺淋巴结混合细胞悬液每只0.2 mL，含细胞数为1×106个，建立AA小鼠模型10只。

    1.4  组织化学方法检测胸腺T?bet蛋白表达水平

    收集正常组和模型组小鼠胸腺，于体积分数为4％的多聚甲醛中固定8 h，然后常规石蜡包埋、切片，按照免疫组化学试剂盒说明操作。免疫组织化学SP法具体步骤如下：

    组织常规脱蜡至水，3％H2O237℃下孵育30 min，以消除内源性过氧化物酶活性。蒸馏水冲洗1 min，PBS浸泡5 min，封闭液封闭：滴加正常山羊血清封闭，37℃30 min，甩去多余液体，勿洗；滴加特异性一抗：滴加1∶50的兔抗鼠T?bet多克隆抗体，37℃孵育4 min。PBS浸泡，5 min×3次；滴加生物素化山羊抗兔二抗IgG，37℃孵育30 min，PBS浸泡，5 min×3次；滴加辣根标记链霉卵白素，37℃孵育20 min。PBS浸泡，5 min×3次；DAB显色，镜下控制反应时间；自来水充分洗涤；苏木素轻度复染，脱水，透明，封片；阳性结果判断标准及表达定量分析：以有棕黄色或棕黑色颗粒为阳性细胞。400倍光镜下观察，从每张切片中于阳性细胞分布区随机选择5个不重复单位视野，以每个视野内的阳性细胞数作为T?bet蛋白的量化指标，计数每个单位视野的阳性率，阳性率＝阳性细胞数/(阳性细胞数＋阴性细胞数)×100％，取其平均值。

    1.6  统计学分析

    所有资料用SPSS13.0软件包进行分析，检测结果以±s表示，经方差齐性检验后，采用检验比较两组间差异，用简单直线相关分析探讨两因素之间相关关系的方向和程度。P＜0.05有统计学差异，P＜0.01有显著统计学差异。

    2  结    果

    2.1  模型验证

    模型组小鼠自第5天起出现食欲明显减退，自第8天陆续出现体重下降。造模后第12天将模型组和正常组BALB/c小鼠经尾静脉取血，肝素抗凝，做外周血网织红细胞计数(见表1)。将濒死小鼠或造模后第20天将所有小鼠颈椎脱臼法处死，常规乙醇消毒，取股骨，于中性甲醛中固定5 h，然后在2％硝酸中脱钙2 h，常规塑料包埋，切片，观察骨髓造血细胞和脂肪细胞。结果示：正常对照组小鼠骨髓增生活跃，脂肪细胞少见；模型组小鼠骨髓增生低下，主要为脂肪细胞，骨髓切片中微血管极度扩张、瘀血、断裂，微血管数明显减少，呈典型AA病理改变。表1  AA组小鼠及正常小鼠组外周血象及网织红细胞计数比较及Rc分别指外周血中性粒细胞、血红蛋白、血小板及网织红细胞。

    2.2  胸腺组织T?bet蛋白的表达变化

    模型组T?bet蛋白的阳性率为(0.41±0.05)％，对照组为(1.06±0.18)％，两组胸腺组织石蜡切片T?bet蛋白的表达水平有显著差异，差异有统计学意义(P＜0.01)。

    2.3  T?bet蛋白与造血功能的关系

    结果显示：T?bet蛋白与网织红细胞相对值、中性粒细胞绝对值(ANC)呈负相关(P＜0.05)，而与血红蛋白、血小板数无明显的相关关系(见图1，图2)。

    3  讨    论

    AA是由于骨髓造血组织显著减少，引起造血功能衰竭而发生的一类贫血，发病机制至今未明，临床应用抗胸腺细胞球蛋白或抗淋巴细胞球蛋白以及环孢素A再障，其有效率为50％～80％［5］，说明免疫异常在再障的发生中起着极其重要的作用。T辅助淋巴细胞根据分泌的细胞因子类型及其功能效应的不同可分为Th1和Th2两种亚型［6，7］。在生理状态下，Th0细胞受到抗原激发后按一定比例分别向Th1细胞和Th2细胞分化，两者处于相对平衡状态。当机体免疫功能异常时Th0细胞分化的Th1和Th2亚群比例及功能失衡，出现相应的Th1和Th2漂移性疾病。实验表明，再障患者Th1、Th2之间的分化平衡被打破，并发展为Th1型图1  T?bet蛋白与网织细胞相对值的关系

    图2  T?bet蛋白与中性粒细胞绝对值的关系

    优势的免疫应答，存在Th1细胞的过度分化和Th1型细胞因子的过度分泌。最新研究表明，Th1细胞转录因子T?bet是Th0向Th1分化的关键因素，已有研究表明T?bet缺失会导致IFN?Y生成障碍，而Th2细胞因子Ⅱ?4和Ⅱ?5分泌增加［8］。若向正在发育和已定型的Th2型细胞转入T?bet真核表达载体则使正在发育和已定型的Th2型细胞重新分化为Th1型细胞［8～9］。

    本实验检测了AA模型组小鼠外周血血象及网织红细胞相对值、胸腺石蜡切片免疫组织化学T?bet蛋白的表达水平并且分析了外周血中性粒细胞绝对值、血小板数、血红蛋白及网织红细胞相对值与T?bet蛋白表达的相关性，结果显示再障模型小鼠外周血象显著低于正常对照组、胸腺中T?bet蛋白高于正常对照组、T?bet蛋白与网织红细胞相对值及中性粒细胞绝对值呈负相关，提示T?bet在AA发病机制中可能起作用，并且T?bet表达与AA病情可能呈正相关。

【】
  ［1］叶任高，陆再英.内［M］.6版.北京：人民卫生出版社，2005：572.

［2］Rosenfeld S，Follmann D，Nunez 0，et al.Antithymocyte globulin and cyclosporine for severe aplastic anemia：association between hematologic response and long?term outcome［J］.JAMA，2003，289(9)：1 130?1 135.

［3］Szabo S J，Kim S T，Costa G L，et al.A novel transcription factor，T?bet，alrects Th1 lineage commitment［J］.Cell，2000，100(6)：655?669.

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