淋巴细胞亚群功能状态的影响〔1〕

【摘要】  目的：探讨黄芪注射液对银屑病患者辅助性T淋巴细胞(Th细胞)亚群功能状态的影响。方法：对20 例银屑病患者的外周血淋巴细胞体外分别经植物血凝素(PHA)和PHA＋黄芪诱导：即病例对照组和病例黄芪组，同时对10 例健康志愿者外周血淋巴细胞体外经PHA诱导(即正常对照组)，各组培养48 h，用ELISA法检测培养上清液中Th类细胞因子IFN?γ和IL?4含量。结果：病例对照组IFN?γ水平高于正常对照组(P＜0.05)，而IL?4水平低于正常对照组(P＜0.05)。病例黄芪组IFN?γ水平低于病例对照组(P＜0.05)，而IL?4水平高于病例对照组(P＜0.05)。结论：黄芪注射液可显著下调银屑病患者Th1亚群优势状态，促进向Th2亚群转换，改善患者Th1/Th2失衡状态，对银屑病的具有重要意义。

【关键词】  黄芪注射液 银屑病 Th细胞亚群 IFN?γ IL?4

 Effects of Astragulus injection on Th cell subset function in patients with psoriasis in vitro

    Abstract  Objective：To study the effects of Astragulus injection on Th cell subset function in patients with psoriasis.Methods：The peripheral blood lymphocytes from 20 patients with psoriasis at the remission stage were stimulated with either phytohem agalutinin(PHA)(patient?control group)or PHA together with Astragulus(patient?Astragulus group)and were then cultured in vitro for 48 hours.The samples from 10 healthy people stimulated with PHA were used as the normal control group.The levels of interferon?γ(IFN?γ) and interleuikin?4(IL?4) in the super?

    〔1〕本课题为山西省青年科技研究基金资助项目(课题编号：20011030)。

    natants of lymphocytes were detected using ELISA.Results：The IFN?γlevel in the patient?control group were statistically higher than those in the control group(P＜0.05).But the IL?4 lever were lower than those(P＜0.05).The level of IFN?γin the patient?Astragulus group were markedly lower than those in the patient?control group(P＜0.05).But the IL?4 level were higher than those(P＜0.05).Conclusion：Astragulus injection can lower the Th1 cell subset and promote disverting to Th2 cell subset，therefor shows an importont significance in treating psoriasis.

    Key words  Astragulus injection；psoriasis；Th cell subsets；IFN?γ；IL?4

    银屑病是一种在遗传基础上与多种因素相互作用的慢性炎症性疾病，目前许多学者倾向于将银屑病归于自身免疫性疾病，其发病与机体T细胞亚群免疫失衡密切相关，认为其发病初期表现为外周血T细胞过度活化［1］，是Th1介导的细胞免疫疾病。中药黄芪对细胞免疫、体液免疫、非特异性免疫功能及细胞因子均有调节作用，实验已证实，黄芪可调节变应性鼻炎、肺癌［2］、糖尿病［3］、过敏性紫癜等疾病的T细胞亚群失衡状态。本研究通过体外检测黄芪注射液对两种主要细胞因子水平的影响，以探讨黄芪注射液对银屑病患者辅助T淋巴细胞亚群功能状态的影响。

    1  资料与方法

    1.1  一般资料

    选择2007年11月—2008年5月门诊及住院的进行期寻常型银屑病患者20 例，男14 例，女6 例，年龄17～65 岁，病程0.5～13年，所有病例均已除外自身免疫性疾病和其他系统性疾病，就诊前1个月未内用及外用糖皮质激素、免疫抑制剂等影响全身免疫功能的药物。对照组为10 例与病例组性别、年龄相匹配的健康志愿者，男5 例，女5 例，年龄25～56 岁。

    1.2  主要试剂与仪器

    淋巴细胞分层液(上海试剂二厂产品)，RPMI1640冻干粉(美国Gibco公司)，新生小牛血清(美国Gibco公司)，植物血凝素(PHA—P)冻干粉(美国Sigma公司)，黄芪注射液(每支10 mL相当于原药材20 g，正大青春宝公司)，人IFN?γ、IL?4定量ELISA试剂盒(北京邦定生物医学公司)，自动化板式酶标仪(ZS—CF 5000型航天总公司)，水平式离心机(LDZ5－2型北京医用离心机厂)，倒置显微镜(Olympus公司)，CO2培养箱(美国Asheville NC)。

    1.3  方法

    1.3.1  淋巴细胞分离与培养

    分别取三组外周静脉血10 mL，肝素抗凝对倍稀释后，以2∶1比例轻轻加入淋巴细胞分离液上，以2 000 r/min，离心15 min，吸取单个核细胞层，经吸附法获得淋巴细胞，Hank′s液洗涤2次，将洗好的细胞用RPMI 1640培养液配成2×107/mL的细胞悬液，取健康人上述细胞悬液200 μL加入1.8 mL含10％胎牛血清的RPMl1640培养液中，植入无菌培养板，设为正常对照组；取患者上述细胞悬液400 μL，均分2份，各200 μL如上加入1.8 mL含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中，植入无菌培养板，1份设为病例未加药组；另1份加入黄芪注射液，终浓度为1 mg/mL，设为病例黄芪组。以上各组中均加入PHA体外诱导淋巴细胞，终浓度5 mg/mL。将培养板置37℃，含5％CO2的孵育箱中，用倒置显微镜观察细胞的生长状况，培养48 h，收集培养上清液500 μL，－20℃冻存备用。

    1.3.2  细胞因子检测

    培养上清液中IFN?γ与IL?4水平采用双抗体夹心法定量ELISA试剂盒检测，操作严格按照试剂盒说明书进行，最后在自动化CF?5000板酶标上测定OD492值(此型酶标仪可直接报告标本的浓度值)。

    1.4  统计学方法

    采用SPSS10.0统计软件包进行分析，所测的实验数据采用±s表示，组间差异用t检验，P＜0.05有统计学意义。

    2  结    果

    2.1  病例对照组和正常对照组IFN?γ与IL?4比较(见表1)

    病例对照组与正常对照组相比，IFN?γ明显升高(P＜0.05)，IL?4明显降低(P＜0.05)，差异均具有统计学意义，提示银屑病患者Th1细胞亚群呈优势状态，Th1/Th2失衡。

    2.2  病例黄芪组和病例对照组IFN?Y与IL?4比较(见表1)

    经黄芪注射液刺激后，病例黄芪组IFN?γ水平明显低于病例对照组P＜0.05，而IL?4水平明显高于病例对照组(P＜0.05)差异具有统计学意义。表1  3组T淋巴细胞培养上清液IFN?γ、IL?4水平比较

    3  讨    论

    CD4阳性T辅助淋巴细胞(简称Th)为一多功能细胞群体，在调节免疫系统中具有双重作用，对免疫反应的启动、最终表现形式和强弱起着关键作用。根据细胞因子分泌模式，CD4＋T细胞可分为Th1和Th2亚群，它们来自一个共同的前体细胞Th0，Th1和Th2是由Th0发育而来的两种极化形式，Th1/Th2漂移需中间形式Th0的过渡。Th1细胞主要与细胞免疫介导的炎症反应有关，Th2细胞主要与体液免疫有关，二者同时还有相互抑制的作用。Th1细胞可分泌IL?2、TNF?α、IFN?γ等，其中最主要的细胞因子是IFN?γ，IFN?γ可以活化巨噬细胞，刺激吞噬活性增强，是银屑病病理生变化过程中重要病因之一。Th2细胞主要分泌IL?4、IL?10等，可抑制巨噬细胞的活化，从而抑制Th1细胞，对自身免疫性疾病有很强的保护作用［4］。IL?4是促进Th0向Th2分化的主要因素，它主要通过活化STAT6蛋白促进Th2分化，STAT6基因敲除的小鼠则Th2细胞分化受损［5］，由此可见，在Th1/Th2平衡中，IFN?γ主要促进Th1的分泌，IL?4主要促进Th2的分化。故本研究选择IFN?γ、IL?4作为检测指标来评价Th1与Th2功能状态。

    正常机体内，Th1/Th2维持着动态平衡。当Th1/Th2失调时，则表现为Th1或Th2细胞中某一亚群功能增强，另一亚群功能减弱，可导致肿瘤、感染、自身免疫性疾病及移植排斥反应。一般而言，Th1反应过度活化可导致器官特异性自身免疫性疾病，如1型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎、类风湿关节炎等；Th2反应过度活化可导致器官非特异性自身免疫性疾病，如变态反应性疾病(哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎)、抗体介导的免疫性疾病(SLE、肾炎、过敏性紫癜)。Austin等［6］从银屑病患者皮损中分离出T细胞，在体外给予刺激，使其分化、增殖并表达细胞因子，发现了Th1细胞分化偏态性。本研究结果显示，病例对照组中IFN?γ水平较正常对照组明显升高(P＜0.05)，IL?4水平明显低于正常对照组(P＜0.05)，呈现Th1类细胞因子优势状态，这与国外报道一致。IFN?γ是角质形成细胞(KC)的促有丝分裂原，且抑制IL?10的表达。给予系统性IFN?γ和升高IFN?γ的药物如锂制剂能诱导或加剧银屑病［7］。IFN?γ在正常情况下有抗增殖作用，但在银屑病中，已证明KC对IFN?γ改变了反应性，表现为对IFN?γ的生长抑制不敏感，反而可提高KC的增殖反应，阻碍KC的分化。可见银屑病患者表皮细胞增殖与IFN?γ过多表达有关。

    黄芪为常用中药，又名独根、二人抬，来源于豆科植物蒙古黄芪和膜荚黄芪的干燥根。其性温和、味甘，具有很强的免疫调节作用，在变应性鼻炎、肺癌、过敏性紫癜、1型糖尿病等疾病的研究中已证实黄芪可调节其Th1/Th2的不平衡状态，且黄芪的免疫调节作用具有双向性，其作用很大程度上取决于机体的免疫状态，有利于调整机体的免疫失衡状态［8］。近年来，应用中药黄芪银屑病已被众多基础及临床研究证明有效［9］。吴凡等［10］用黄芪注射液灌饲病毒性心肌炎小鼠2周后发现，小鼠心脏组织中IL?2和TNF?α的mRNA表达下降，IL?10mRNA表达则升高，表明黄芪可通过调节细胞因子在心脏组织的表达，抑制炎症反应，从而发挥其治疗作用。本研究结果显示(病例黄芪组)黄芪注射液与银屑病患者外周血淋巴细胞共同培养后，IL?4水平明显高于病例对照组(P＜0.05)，而IFN?γ水平低于病例对照组(P＜0.05)，提示黄芪可下调银屑病患者病理性Th1优势状态，促进向Th2优势状态转换，上调IL?4表达水平，抑制细胞免疫反应，促进其在自身免疫反应中的免疫保护作用，逆转Th1/Th2失衡状态，这可为黄芪注射液临床治疗银屑病提供一定的理论依据。

【】
  ［1］Barker J N.Pathogenesis of psoriasis［J］.J Dermatol，1998，2(12)：778?781.

［2］张春玲，肖伟.黄芪对正常人及肺癌病人外周血Th1/Th2状态的影响［J］.上海医药，2000，21(8)：37?39.

［3］吴晓琰，陈蔚，俞茂华.黄芪多糖对糖尿病鼠胰岛IL?4、IFN?γ的影响［J］.康复理论与实践，2008，14(2)：147?149.

［4］Rabinnovitch A.Perspectives in diabetes：immunoregulatory and cytokine imbalances in the pathogenesis of IDDM：therapeutic intervention by immunostimulation?［J］.Diabetes，1994，43(5)：613?621.

［5］Ouyang W J，Lohnign M，Gao Z G，et al.STAT6?independent GATA?3 autoactivation directs IL?4 independent TH2 development andcommitment［J］.Immunity，2000，12：27.

［6］Austin L M，Ozawa M，Kikuchi T，et al.The majority of epidermal T cell in psoriasis vulgaris lesions can produce typel cytokines，interferon?γ，interleukin?2，and tumor necrosis factor?a，defining Th1 and Thl effector populations：a type 1 differentiation bias in also measured in circlulating blood T cells in psoriatic patients［J］.J Invest Dermalol，1999，113(5)：752?759.

［7］Wolfer L U，Goerdt S，Shroder K，et al.Interferon—alpha induced psoriasis［J］.Hantarzt，1996，47：124?128.

［8］邵民象，于秉新.浅析黄芪药理作用的双向性［J］.实用中西医结合杂志，1997，10(16)：1 586?1 587.

［9］刘晓明，齐欣，宋智琦.黄芪注射液治疗银屑病患者的临床观察和实验研究［J］.中华皮肤科杂志，2001，34(2)：113?115.

［10］吴凡，邱汉婴，董继华.黄芪对病毒性心肌炎心脏细胞因子mRNA表达的影响［J］.临床心血管杂志，2004，20(3)：165.