CYP450在SAP组织中的表达及对临床治疗的指导意义

【摘要】  目的：研究急性重症胰腺炎(SAP)模型中CYP450(细胞色素P450)在组织中的表达及对临床的指导意义。方法：以3％牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射制备鼠SAP模型，检测血清淀粉酶，采用免疫组织化学方法分别对雄性SD大鼠SAP制备模型术后4 h、12 h及正常对照组标本中CYP450的表达进行检测。结果：CYP450主要表达于胞浆，SAP模型组空肠、肝脏组织中的CYP450表达均明显高于正常对照组(P＜0.001)。结论：CYP450在大鼠SAP中表达显著增强，提示其在SAP的疾病及临床治疗中都具有重要意义。

【关键词】  细胞色素P450 急性重症胰腺炎 肝脏 空肠

    Abstract  Objective：To investigate the dynamic expression of hepatic cytochrome P450(CYP450)in early severe acute pancreatitis(SAP).Methods：SAP was induced by retrograde injection of 3％sodium taurocholate into the bilipancreatic duct，the activity of serum amylase was investigated.Immunity histochemistry method was used for detecting MCP?1 expression in model of SAP 4 h，12 h and normal control ones in male rats.Results：CYP450 is fundamental expressed in endochylema.The expression of CYP450 which in tissues of jejunum，liver are conspicuous higher than the normal control ones.Conclusion：It seemed that CYP450 plays a pivotal role in the development and clinical treatment of SAP.

    Key words  cytochrome P450；severe acute pancreatitis；liver；jejunum

    近年来，随着人民生活水平的提高及生活饮食习惯的改变，急性胰腺炎的发病率呈明显上升趋势。急性重症胰腺炎(SAP)的确切发病机制尚未完全阐明，近年来的研究表明，CYP450(平均积分光密度)可能在SAP发病过程中有着重要作用。本研究采用牛黄胆酸钠制备大鼠SAP模型，通过观察肝脏及空肠组织中细胞色素P450蛋白的表达情况，并结合肝功能，拟系统探讨细胞色素P450的表达在SAP发生中的地位及其可能机制，以期进一步探明SAP的发病机制，并为临床干预提供重要线索。

    1  资料与方法

    1.1  一般资料

    健康雄性SD大鼠，清洁级，体重250～300 g，由河北医科大学实验动物中心提供。CYP450单克隆抗体由北京博奥森生物工程有限公司提供，免疫组织化学试剂盒由山西医科大学寄生虫教研室提供。

    1.2  动物模型的制备及分组

    30只大鼠，随机分为3组，每组10只。假手术组(SO组)；SAP 4 h组；SAP 12 h组。其中假手术组直接手术取出相应组织。模型制作简要步骤：大鼠术前禁食禁水12 h，3％戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔内注射麻醉后，仰卧位固定于无菌手术台，消毒腹部皮肤，正中切口入腹，沿胃窦向下首先找到十二指肠，在其内侧见片状分布的胰腺组织及半透明的胰胆管汇入十二指肠乳头。肝门部胆管动脉夹夹闭后，从胆胰管开口十二指肠对系膜缘侧穿刺肠壁进入胆胰管开口后，于十二指肠乳头处用手指捏闭胆总管末端。经微量注射泵缓慢匀速(18 mL/h)注入3％牛磺胆酸钠(1 mL/kg)，注射时间1 min。5 min后去除动脉夹，局部压迫肠壁穿刺处，双层关腹。造模后所有动物均皮下注射生理盐水5 mL，以补充血容量不足。

    1.3  血清淀粉酶检测

    在各时间点处死大鼠，迅速入腹抽取下腔静脉血，分离血清，用于脂肪酶及淀粉酶测定。

    1.4  表达测定

    分别取三组大鼠的肝脏、空肠组织，置4％多聚甲醛中固定，石蜡包埋，行4 μm厚全层切片及HE染色，并采用免疫组织化学法检测肝脏、空肠组织中CYP450的表达。各组织切片常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化后滴加3％H2O2溶液10 min(去除内源性过氧化氢酶活性)，修复抗原(高压修复)，冷却至室温后依次按说明书完成免疫染色各步骤。用已知阳性片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。结果进行显微摄片，并用由山西医科大学生理教研室提供的医学图像分析系统对各组标本进行图像采集、预处理、图像分割、分析，每张切片在高倍镜下随机选择≥10个视野，以出现棕黄色染色为阳性信号，以均值表示每个视野CYP450(胞浆表达)的积分光密度。

    2  结    果

    2.1  血清淀粉酶

    与SO组比较，SAP 4 h、12 h组血淀粉酶随时间延长有明显升高(P＜0.01)(见表1)。表1  各组大鼠血脂肪酶及淀粉酶损伤动态观察

    2.2  胰腺组织病结果

    肉眼观察：正常组大鼠胰腺、胰周脂肪、网膜均无异常，无腹腔积液；SAP组术后4 h大鼠胰腺明显肿胀，表面点片状出血，肝脏深红肿大，空回肠组织明显红肿，腹腔内中量血性腹腔积液；12 h组大鼠胰腺肿胀呈暗紫色，分叶结构模糊出现沿胰胆管及胰腺组织分布的点片状皂化斑。

    镜下观察：SO组各组织正常，无炎细胞浸润及红细胞渗出。胰腺炎术后4 h，胰腺间质充血、水肿，少量散在的腺泡坏死灶，部分胰管破坏，坏死区边缘炎细胞渗出明显；胰脉炎术后12 h组，胰腺实质大片灶性坏死，间质出血，脂肪坏死，大量红细胞沉积，血管扩张，并有大量中性粒细胞浸润，广泛聚集、黏附，浸润至组织间隙，小叶结构破坏。空肠黏膜出现程度不等的坏死、溃疡，组织增生，肠黏膜细胞弥漫性涨大，肠壁增厚，肠腔变小；肝细胞胞浆疏松化，并可见散在的嗜酸变性及点状坏死灶。

    2.3  免疫组织化学法检测肝脏、空肠组织中CYP450的表达

    CYP450在肝脏中主要表达于实质及间质细胞胞浆中，在空肠组织中主要表达于上皮及间质细胞胞浆。在造模术后不同的时间，肝脏及空肠中的表达均显著高于SO组(P＜0.001)(见表2)。

    3  讨    论

    细胞色素氧化酶450(CYP450)是一组结构和功能相关的超家族基因编码的同工酶，主要存在于生物体的内质网内，是混合功能氧化酶中最重要的一种酶系，主要参与各种内源性(如内固醇激素、维生素D胆酸等)和外源性(如药物、化学毒物，致癌物等)化合物在体内的代谢过程，在肝脏的解表2  SAP组及正常组织中CYP450的表达

    毒功能中起关键作用［1～4］。多种药物和环境因子甚至食物成分都能诱导或抑制CYP450活性，而CYP450活性变化可改变一些药物在体内的药效和毒性。急性胰腺炎尤其是重症胰腺炎是临床上常见的、伴有全身多脏器病理改变的急腹症，因此研究胰腺炎状态下药物代谢过程的改变，对于临床上药物的合理安全使用无疑具有重要意义，并为临床干预等提供重要线索。

    CYP450家族拥有众多亚型。研究发现［5，6］，其中的CYP4502E1不仅参与很多药物在体内的代谢，而且还能催化许多前致癌物和毒物的活化过程，如乙醇、对乙酰氨基酚、四氯化碳、三氯乙烯、氯仿、苯等物质的体内代谢都与CYP450有关，同时这些化合物亦是CYP450的有效诱导剂。奥美拉唑是临床上胰腺炎的常规用药，许建明等［7］对健康人群所做的奥美拉唑实验发现，人群中的CYP2C19具有基因多态性，存在纯合子强代谢型(homEM)、杂合子强代谢型(hetEM)和弱代谢型(PM)3种基因型［8］，且CYP2C19基因多态性对奥美拉唑抑酸效果有较大影响，表现为pM＞hetEM＞homEM，表明CYP2C19基因型的检测是奥美拉唑个体化给药重要的标准。CYP450家族中既有与体内前致癌物、毒物等组织损伤因素密切相关的亚型，也有对疾病的临床治疗效果有重要影响的亚型，表明CYP450在体内组织中的表达对全身疾病的发生、及治疗都有重要影响。本实验通过采用牛黄胆酸钠胰胆管逆行注射制备大鼠SAP模型，光镜下HE染色见SAP模型出现全小肠、全层性炎症，组织黏膜出现坏死溃疡，组织增生，肠壁增厚，伴有大量炎性细胞浸润，偶见肉芽肿形成。肝脏组织胞浆疏松化，嗜酸性变及坏死，肝脏实质发红肿大，并伴有深红色的点状坏死灶。免疫组化法分别检测SAP大鼠模型空肠及肝脏组织中的CYP450的表达，结果发现SAP模型组大鼠组织中的CYP450表达显著高于正常对照组(P＜0.001)，且表达随时间变化有增加趋势。

    CYP450的功能活性直接影响外源性化合物在体内的代谢转化，从而在一定程度上决定了其产生自由基、亲产物及自身抗体等毒性代谢产物的能力，并且CYP450在组织中的表达对临床药物在体内的代谢及疗效亦具有重要影响，一些影响CYP酶活性的因素也必然影响到CYP代谢过程和其后的一系列下游事件。许多因素可以影响CYP450的活性，如年龄、性别、遗传、营养状态、疾病、能诱导或抑制CYP450酶的药物或食物，以及接触有毒物质(如乙醇、烟草、杀虫剂等环境中的有害物质)的时间及强度等［9，10］。因此，在临床疾病如SAP类累及全身多脏器病变的治疗过程中，检测患者各组织中CYP450的表达对患者的个体化用药亦具有重要意义。

【参考】
  ［1］Porter T D，Coon M J.Cytochrome P450［J］.J Biol Chem，2004，266(21)：13 469?13 472.

［2］Nelson D R.Cytochrome P450 and the individuality of species［J］.Arch Biochem Biophys，2007，369(1)：1 210.

［3］Pirmohamed M，Park B K.Cytochrome P450 enzyme polymorphisms and adverse drug reactions［J］.Toxicology，2003，192(1)：23 232.

［4］刘移民.细胞色素氧化酶P450研究新进展［J］.卫生毒杂志，2000，14(4)：243?244.

［5］Zangar R C，Benson J M，Burnett V L，et al.Cyto?chrome P450 is the primary enzyme responsible for lowdose carbon tetrachloride metabolism in human liver microsome［J］.Chem Biol Interact，2000，125(3)：233?243.

［6］Haouzi D，Lekehal M，Moreau A，et al.Cytochrome P450?generated reactive metabolites cause mitochondrial Permeability transition，caspase activation，and apotosis in rat hepatocytes［J］.Hepatology，2000，32(2)：303?311.

［7］许建明，梅俏，徐新华，等.细胞色素P450 2C19基因多态性对奥美拉唑胶囊抑酸效果的影响［J］.临床药理学杂志，2006，22(1)：9?22.

［8］Demorais S M，Wilkinson G R，Blaisdell J，et al.Identification of a new genetic defect responsible for the polymorphism of(S)?mephenytoin metabolism in Japanese［J］.Mol Pharm Acol，2004，46：594?598.

［9］Shen A L，Kasper C B.Role of acidic residues in the interaction of NADPH cytochrome P450 oxidoreductase with cytochrome P450 and cytochrome C［J］.J Biol Chem，2005，270(46)：27 475?27 480.

［10］梁立世.重症急性胰腺炎手术与非手术治疗疗效对比［J］.临床医药实践，2008，11(2)：114?115.