3种方法检测痰结核分枝杆菌的比较

                      作者：尚慧锋，陈国光，王 艳，王玉珀 

【摘要】  目的：探讨建立更快速、准确的痰结核分枝杆菌检测方法。方法：采用涂片抗酸染色法、快速结核菌培养法和荧光定量PCR技术对痰结核分枝杆菌进行检测，并对其检出率进行比较。结果：荧光定量PCR技术的检出率最高，快速培养法次之且检测时间较长，抗酸染色法检出率最低。结论：荧光定量PCR技术能对痰结核分枝杆菌进行简便、快速、敏感、特异的检测，在肺结核的早期诊断和疗效观察中将能发挥重要作用。

【关键词】  涂片抗酸染色法；快速结核菌培养法；荧光定量PCR技术；结核分枝杆菌；阳性率比较

目前从痰中检测结核分枝杆菌仍是诊断肺结核的重要方法，痰结核分枝杆菌检查对发现传染源、确定方案、考核疗效、评价防治效果等具有重要意义。本文对558 例肺结核患者及疑似患者痰标本同时进行涂片抗酸染色法、快速结核菌培养法和荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌，并对3种方法的阳性率进行比较，为临床提供更实用、的检测方法。

　　1  资料与方法

　　1.1  标本

    558 例痰标本来自本院门诊和病房的肺结核患者及疑似患者，嘱患者清晨嗽口，然后从深部咳痰2～3口于一次性无菌塑料瓶内送检。

　　1.2  试剂与仪器

    萋?尼氏染色试剂(按［1］的方法自行配制)、痰消化液、pH6.8的磷酸盐缓冲液、结核分枝杆菌PCR荧光定量检测试剂盒及DA7600荧光定量PCR仪(深圳达安生物技术有限公司提供)、显微镜(日本奥林巴斯)、低温高速离心机(美国Thermo Fisher Scientific)、生物安全柜(美国NUAIRE)、BacT/ALERT 3D全自动分枝杆菌培养检测系统(购于生物梅里埃有限公司)。
　
　　1.3  方法

　　1.3.1  涂片抗酸染色法　

    所有操作严格按照《抗酸杆菌涂片检查操作程序》(疾病预防控制中心结核病防治临床中心与国家结核病参比实验室制订)进行。

　　1.3.2  快速结核菌培养法

    取痰标本，采用半胱氨酸?氢氧化钠法前处理(左旋半胱氨酸临用时配制)。视标本性状，加1～2倍体积的处理液于无菌痰杯中，使痰液充分液化，整个处理时间不超过20 min，移入50 mL离心管振荡均匀并加入pH6.8的磷酸盐缓冲液至50 mL处，4 000 rpm离心20 min，弃上清液，加0.2％牛血清1 mL，混匀。取0.5 mL加入到BacT/ALERT 3D培养管(预先以75％乙醇消毒瓶口，待风干后，加入0.5 mL抗生素补充剂)，以上操作均在生物安全柜内进行。BacT/ALERT 3D培养管置仪器培养，去除阳性标本，阴性标本42 d报告结果［2］。

　　1.3.3  荧光定量PCR技术

    取痰标本，加入4倍体积的4％氢氧化钠溶液，摇匀，室温液化30 min，取1～1.5 mL，15 000 rpm离心5 min，弃上清液，沉淀用无菌生理盐水1 mL打匀，15 000 rpm离心5 min，重复洗涤1次，弃上清液，沉淀加入50 μL DNA提取液，充分混匀后沸水浴10 min，10 000 rpm离心5 min，取5 μL样本加入到PCR管内，设置反应体系，扩增完机自动分析，建立标准曲线，计算出标本中扩增片段的拷贝数。

　　2  结果 

　　(见表1)表1  3种检测结核分枝杆菌方法的阳性率结果（略）

　　3  讨 论

    结核病是一种感染性疾病，病因很明确，实验室诊断是确诊的主要依据。对肺结核诊断最有价值的是细菌学检查，由于菌阴肺结核在肺结核中占相当大的比例，抗酸染色阳性率低，灵敏度和特异性也很差，并受送检标本质量影响较大［3］，结核菌快速培养所需时间较长，阳性率也较低，给肺结核的早期诊断带来困难。本文结果表明，3种方法对558 例痰标本中结核菌的检出率差异有显著性(P＜0.05)，荧光定量PCR技术检测的阳性率为47.8％，明显高于涂片抗酸染色法和快速结核菌自动培养，这与国内相关报道基本相同［4］。另外整个荧光定量PCR检测过程包括扩增样本的制备和检测报告的发出，仅需要5～6 h，大大缩短了结核分枝杆菌的检出时间，可以作为肺结核患者早期诊断和鉴别诊断的重要依据，还可以通过相对定量检测体现病原体含量与复制水平、感染程度之间的关系，为评价和考核效果及监测疾病和转归提供有效信息，是一种简便、快速、特异的结核分枝杆菌检测方法。3种检测方法的敏感性比较，荧光定量PCR技术也明显高于快速结核菌培养法、涂片抗酸染色法。3种方法阳性报告时间比较，涂片抗酸染色法和荧光定量PCR技术远比快速结核菌培养法要短，而涂片抗酸染色法的阳性检出率很低，对临床早期诊断和治疗帮助有限。

    目前，PCR技术已广泛用于感染性疾病、肿瘤、遗传病等疾病诊断及生物工程等各个方面。传统PCR技术在临床应用仍有一定局限性，其原因主要表现在对核酸样本的分离纯化过程中引起的假阴性和由于扩增产物污染和实验操作所致标本污染引起的假阳性两个方面。荧光定量PCR技术克服了传统PCR技术易污染、假阳性率高的缺点，具有操作简单、结果可靠、重复性和特异性好、灵敏度高、可定量等优点。
   
　　当然，仅凭1次荧光定量PCR结果就作出诊断是片面的，还应结合临床表现、影像学检查及其他实验室相关检验等综合判断，可疑患者还可以复查或用支气管肺泡灌洗液检测结核分枝杆菌。研究已经证明，人类疾病大都直接或间接与基因有关，临床实验医学正在进入基因诊断时代，应用荧光定量PCR技术检测痰中的结核分枝杆菌可作为可疑肺结核患者的首选检查之一，尤其是对因菌量少或细菌发生L型变异而不易分离培养成功的标本更有实用价值，并应成为临床结核分枝杆菌实验诊断的常规技术［5］。

【文献】
  　　［1］中华人民共和国卫生部医政司.全国临床检验操作规程［M］.3版.南京：东南大学出版社，2006：791?798.

　　［2］杨顺利，范梦柏，张吉平.结核菌培养方法对照与效果分析［J］.药物与临床，2007，7：10.

　　［3］叶林德.肺结核患者痰液性状对检测结果的影响［J］.浙江预防医学，2002，14(7)：80.

　　［4］张翊，卢建平，叶淼.四种结核分枝杆菌检测方法的临床应用评价［J］.中国防痨杂志，2006，28(1)：14?17.

　　［5］陈红兵，周志红，贺润年，等.荧光定量PCR技术在结核杆菌检测中的应用［J］.实用医学杂志，2008，24(21)：3 765?3 767.