人髂骨生长板软骨细胞的体外培养及鉴定

【摘要】  探讨人髂骨生长板软骨细胞体外培养的可行性并观察其生物学特征。［方法］对手术中获得的10例青少年特发性脊柱侧凸患者髂骨生长板软骨行体外分离、培养，观察细胞形态，MTT法测定细胞增殖，Ⅱ型胶原免疫组化染色，采用逆转录聚合酶链反应检测各代细胞Ⅱ型胶原mRNA的表达水平。［结果］（1）体外培养的软骨细胞随着传代次数的增加，细胞形态由原代的多角形逐渐变为长梭形；（2）MTT 比色法检测显示，第2 代髂软骨细胞的生长曲线近似倒“S”形，在第4～8 d细胞呈对数生长，在9～10 d达平台期，至第11 d开始出现生长抑制。（3）第2 代细胞Ⅱ型胶原免疫组化呈强阳性。（4）Ⅱ型胶原mRNA表达水平从第2代后随着传代次数的增加逐渐下降。［结论］采用联合酶序贯消化法将软骨细胞悬液和软骨块共同体外培养髂软骨细胞简单、有效，P2代细胞很好的保持了软骨细胞的特性，可以作为种子细胞来源。

【关键词】  软骨细胞 单层培养 物学特性 脊柱侧凸

    Abstract: ［Objective］To establish a viable and convenient method for human iliac growth-plate chondrocyte culture in vitro and study the biological characters of the chondrocyte. ［Method］ The chondrocytes from 10 human iliac growth-plate were cultured in monolayer and passaged to observe the changes of cell morphology. The growth kinetics was detected by using MTT colorimetric. Immunocytochemistry and RT-PCR were performed to investigate the expression of collagenⅡat the protein and mRNA level ,respectively. ［Result］(1) The phenotype of chondrocyte was changed from original polygonal shape to fusiform at 4th passage. (2) MTT test showed the growth curve of the second passage cells presented inverted "S",and cells were found logarithmic growth at 4th～8th day reached platform stage at 9th～10th day,and decreased at  the 11th day.(3)The collagen typeⅡimmunohistochemical staining was extensive positive in cells at P2. (4) RT-PCR confirmed that the mRNA level decreased with the cells passaged after P2. ［Conclusion］The modified method of the enzymatic two-step digestion is an effective and simple procedure. The second passage cells maintain the phenotype of chondrocyte well, could be serving as seeding cells.

    Key words：chondrocyte;  monolayer culture;  biological characteristics; scoliosis

    软骨细胞体外培养对于研究骨形成机理、骨骼系统疾病发病机理具有重要的意义，同时也可为组织工程提供种子细胞，是进行骨科相关领域基础研究的一项重要技术。其体外培养受培养条件、取材部位、研究对象年龄等多因数的影响，细胞活力、增殖能力、去分化能力差异明显［1、2］。众多研究的取材偏向于年龄较小的肋软骨、关节软骨、鼻中隔软骨等［3、4］。而人髂骨生长板软骨的体外培养，鲜有报道。本实验对软骨细胞体外培养传统方法进行改良，用以培养青少年髂骨生长板软骨，并对其生物学特征进行鉴定，以探讨作为种子细胞的可行性。

    1  资料与方法

    1.1  一般资料

    青少年特发性脊柱侧凸(adolescent idiopathic scoliosis，AIS)患者后路矫形手术时获得髂骨生长板软骨10例，全部为女性；年龄12～14岁，平均13.1岁，Cobb’s角44°～ 70°，平均53.2°，其中LenkeⅠ 5例，LenkeⅡ 1例，LenkeⅢ 2例，LenkeⅤ 2例。

    1.2  主要仪器与试剂

    DME培养液(pH7.2,Gibco)，胎牛血清(FBS, Gibco)，0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco),Ⅱ型胶原酶(Gibco)，双抗(青霉素、链霉素)（sigma），Ⅱ型胶原一抗、二抗（北京中杉金桥），DAB显色液(北京中杉金桥)，Trizol Reagent ( Invitrogen)， RT- PCR 试剂盒(Invitrogen)，琼脂糖( Promega)，CO2细胞培养箱(NAPCO)，倒置相差显微镜及照相系统(Olympus)。

    1.3  细胞分离和培养

    术中取得的标本置于预装PBS离心管中，立即送入实验室，在超净台内仔细去除软骨周围的韧带及结缔组织，将软骨块剪至1 mm×1 mm×1 mm大小，采用两步酶消化法(0.25%胰蛋白酶-EDTA消化30 min、0. 2%Ⅱ型胶原酶消化4～6 h)消化后，收集细胞并计数，台盼蓝试验测定细胞活性后，将未完全消化的软骨块及软骨细胞共同接种于含10%FBS DMEM培养皿中，在5%CO2培养箱中，饱和湿度、37℃条件下培养，每3～4 d换液一次，待细胞近融合时，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化2～3 min，计数后按1∶3或1∶4传代。

    1.4  观察指标

    1.4.1  细胞形态学

    培养的软骨细胞在倒置显微镜下观察细胞形态的变化并照相。

    1.4.2  MTT比色法测定细胞增殖

    取P2代细胞计数后接种于96孔培养板中，每孔3000个细胞，分别接种12孔，每孔设3复孔，空白调零孔加0.2 ml无血清DMEM，置CO2孵箱中37 ℃培养，隔天换液。每天取出3孔进行检测，弃去培养液后，加入200 μl MTT溶液，孵育4 h，吸去MTT溶液，加入200 μl DMSO溶解紫蓝色结晶，振摇5 min，置酶标仪570 nm波长测定光密度值(OD值)。

    1.4.3  Ⅱ型胶原免疫细胞化学

    对P2代细胞用爬片技术，待细胞贴壁后2～3 d取下载玻片，PBS浸泡3次，每次10 min；3%过氧化氢室温下孵育10 min；PBS 浸泡3次，每次5 min，加丙酮固定30 min，PBS浸泡3次，每次10 min，10%牛血清白蛋白室温下封闭20 min；弃去液体，滴加1∶100的一抗4 ℃下过夜(空白对照加PBS); PBS 洗3次，每次10 min;滴加1∶100的二抗，37 ℃孵育30 min ;PBS浸泡3次，每次10 min;DAB显色(按说明书操作)，苏木素复染，脱水，封片。

    1.4.4  RT-PCR测软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达

    取P1～P4代细胞，Trizol裂解细胞，抽提总RNA，使用Invitrogen公司的两步法进行RT-PCR反应，PCR反应条件: 94  ℃5 min，94 ℃45 s，60 ℃30 s，72 ℃45 s，循环30次，72 ℃延伸10 min，4 ℃结束。Ⅱ型胶原(colⅡ)，β-actin引物序列和扩增产物大小见表1。将PCR扩增产物进行电泳。采用Smart-view 2001生物电泳图像分析系统对电泳条带灰度值进行半定量分析。

    1.5  统计学处理

    实验数据用x-±s表示。采用SPSS 13. 0 统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA) 和t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。表1  ColⅡ和β-actin引物序列和扩增产物大小Sense primerReverse primerProduct size (bp)ColⅡ5′-TCCCCGGCAAC-

  2  结果

    2.1  倒置相差显微镜下观察：

    每克软骨组织经酶消化后获得(0.51±0.15)×106细胞，活力90%以上。刚接种的软骨细胞呈小圆球形，折光性强，悬浮于培养液中，细胞的大小基本一致。培养24～ 36 h后原代细胞贴壁完成，呈扁平状，多角形，胞浆丰富，胞核清晰，可见 1～2个核仁(图1)。培养10～13 d后，原代细胞90%融合，细胞形态不规则，呈多边形、星形等，紧密排列成“铺路石”状外观，消化传代后，6 h可见部分细胞已贴壁，增殖较快，5～6 d后即可见细胞90%融合(图2，图3)。随着传代次数增加，细胞逐渐变为长梭形(图4)，4代后长梭形细胞逐渐增多，镜下细胞长而大，折光性差，部分细胞脱落，悬浮于培养液中。

    2.2  细胞活性检测结果

    四唑盐MTT比色法检测显示，第2代软骨细胞的生长曲线近似倒“S”形，1，2，3 d处于生长潜伏期，4，5，6，7，8 d细胞呈对数生长，约在 9，10 d达平台期，至第11 d开始出现生长抑制，如图5所示。

    2.3  细胞免疫化学

    Ⅱ型胶原免疫组织化学观察显示P2代软骨细胞核周围可见棕褐色颗粒染色呈片状或团块状，为阳性结果(图6)；空白对照不染色(图7)。

    2.4  Ⅱ型胶原mRNA表达

    第1代及第2代Ⅱ型胶原含量相对较高，两者间差异无显著性意义。从第3代开始表达量明显下降，差别具有统计学意义，而内参β-actin在各代中表达量恒定。结果见表2及图8。

    表2  不同代细胞Ⅱ型胶原mRNA表达量组别Ⅱ型胶原mRNA表达(x-±s)P11.17±0.17P21.16±0.12P30.55±0.07*P40.27±0.08**    *P3与P1和P2比较，P＜0.05，**P4与P3比较，P＜0.05

    3  讨论

    3.1  软骨细胞分离培养

    1965年Smith首先将体外培养的软骨细胞用于软骨缺损修复，此后，培养方法不断改进并逐渐成熟，随后Manning等联合运用胰蛋白酶和胶原酶相结合的方法消化关节软骨，使软骨细胞从坚韧的软骨基质中分离，获得了数量多、纯度高的软骨细胞，接种于培养基中，软骨细胞能生长分裂，从而改变了软骨细胞不能分裂的传统观点。本研究借鉴其方法并加以改进，采用联合酶序贯消化后将软骨细胞悬液和软骨块共同培养，细胞得率(0.51±0.15)×106/ g，存活率达到90%。张英等［5］单用0.05%Ⅱ型胶原酶消化8～10 h，胎儿关节软骨细胞获得率达(3.5±0.4)×107/ g，活力为85%，张艳［2］采用不同浓度Ⅱ型胶原酶（0.05%，0.15%）分别消化人残耳软骨及肋软骨标本16 h，细胞获得率分别为(1.54 ±0.14)×106/ g、(0.46±0.09)×106/ g ,另有年龄超过20 岁的患者肋软骨骨化明显,没能消化获得软骨细胞。胶原酶具有细胞毒性，消化时间过长, 可造成细膜通透性或膜电位的改变，细胞水肿甚至破裂。本实验采用0.25%胰蛋白酶预消化30 min,再用0.2%胶原酶进一步消化。胰蛋白酶的主要作用是使细胞间质的蛋白质水解,但浓度过大和时间太长,也可损伤细胞。如此缩短了细胞浸泡于消化酶中的时间，最大限度地保护软骨细胞的完整性和活性，获得较高活力的细胞。另外，本实验把未完全消化的软骨块与软骨细胞共同培养，软骨块可作为软骨细胞生长的支架，为软骨细胞生长提供了更好的生长背景。MTT实验结果显示P2代软骨细胞生长的潜伏期在1～3 d左右，在这一期间细胞增殖缓慢，指数增长期在4～8 d之间，此期是细胞一代中活力最好的时期，是进行各种实验最佳的和最主要的阶段，随后进入平台期，平台期的时间为第9～10 d。第10 d后，细胞仍有少量增殖，由于细胞的相互接触开始产生接触抑制，总体水平骤减。这些数据表明，联合酶序贯消化法将软骨细胞悬液和软骨块共同体外培养，操作简单，切实可行。  图1P0髂软骨细胞 100×  图2P1髂软骨细胞 100×  图3P2髂软骨细胞 100×  图4P4髂软骨细胞 100×  图5P2髂软骨细胞生长曲线  图6Ⅱ型胶原免疫组化，阳性表达100×  图7Ⅱ型胶原免疫组化，空白对照100×  图8不同代细胞Ⅱ型胶原mRNA的表达情况3.2  软骨细胞的生物学特性

    软骨由软骨细胞和胞外基质(包括胶原、蛋白多糖、透明质酸、糖蛋白等)组成。软骨细胞是软骨组织的主要细胞成分，在软骨的生长及功能代谢中起着重要作用。糖胺多糖( glycosaminoglycans，GA G)及Ⅱ型胶原是软骨细胞外基质中的重要成分，Ⅱ型胶原的合成与分泌可作为软骨细胞维持其分化表型的特定指标［6、7］。但在体外单层培养过程中易发生去分化现象，尤其是成人软骨细胞，随着传代次数的增加，合成和分泌的Ⅱ型胶原逐渐减少。本实验mRNA表达水平表明第1、2代细胞Ⅱ型胶原表达明显，而第3代开始Ⅱ型胶原表达逐渐减弱，因此在第2代以前软骨细胞能维持其特征性表型，具有良好功能。

    3.3  软骨细胞体外培养的意义

    体外培养技术，其本质是模拟机体内的生理环境，在无菌，适宜的温度、湿度以及一定营养条件下，使活体的结构成分在体外环境中得以生存和生长，并维持其结构和功能。临床上软骨大面积缺损可以通过软骨组织工程方法得到修复，将自体软骨细胞体外扩增后再回植入体内，回植的细胞能与周围组织具有很好的相容性，保持了良好的合成分泌功能，从而修补缺损［8］。软骨组织工程的来源部位有肋软骨、关节软骨及鼻中隔软骨，本实验从髂软骨成功培养出种子细胞，该部位取材方便，可以作为组织工程的候选部位。

    另外，软骨细胞体外培养体系的成功建立，可以排除体内众多因素的干扰，为研究与软骨形成异常等相关疾病的病因及发病机理提供种子细胞。众多学者利用此技术开展退行性、发育性等相关脊柱疾病发病机理的研究工作， 已取得了丰硕的成果。AIS是一种复杂的脊柱三维畸形，在众多的发病因数中，生长发育异常是目前研究的热点之一。Ylikoski［9］大体形态学测量发现AIS 女孩矫正身高要显著高于健康女孩的平均身高。Zhu等［10］从组织学研究表明AIS前后柱软骨细胞增殖活跃不同，前柱高于后柱，并影响侧凸的进展。Moreau等［11］证实AIS患者成骨细胞水平cAMP信号通路存在异常，而cAMP作为第2信使在细胞中普遍存在，该通路软骨细胞中是否异常有待进一步研究。因此，从分子生物学及细胞水平探寻AIS患儿体内软骨内成骨及信号传导情况，为深层次的探寻AIS 病因学研究提供了新的思路。作者采用联合酶消化法分离、培养获得种子细胞，为后续研究打下基础。

    综上所述，采用联合酶序贯消化法将软骨细胞悬液和软骨块共同体外分离培养软骨细胞，可以获得数量多、活性优的软骨细胞，为软骨组织工程及研究相关疾病发病机理提供种子细胞。在本研究的基础上，作者认为P2代细胞作为相关研究的种子细胞最为理想。

【】
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