肌腱组织工程和基因转染

【摘要】  骨髓源间充质干细胞是肌腱组织工程最为常用的种子细胞。脂肪源干细胞具备相似的多分化潜能，有望成为肌腱组织工程的种子细胞。 纳米纤维材料可以模拟细胞外基质的结构和功能，作为肌腱组织工程的支架有明显的优越性。基因转染技术可克服外源性细胞因子在肌腱修复处作用短暂的不足。肌腱组织工程及基因转染的前景令人鼓舞，但仍面临诸多挑战，需进一步研究。

【关键词】  肌腱损伤； 修复和再生； 间充质细胞； 生长／分化； 组织工程； 基因

    Abstract：Currently,bone marrow derived mescenchymal stem cells (MSCs) are the best available cell population for tendon tissue engineering.Recent adipose?derived MSCs show characteristics of multipotentital and may be used as functional cells for tendon tissue engineering.Nanofiber scaffolds can mimic the structure and function of extracellular matrix,and have advantages for tendon tissue engineering.A variety of gene transfer techniques can be used to maintain local concentrations of growth factor at tendon repair site.Although tremendous progress has been achieved in the field of tendon tissue engineering,many challenges remain and much work still needs to be done.

    Key words：tendon injury;     repair and regeneration;     mescenchymal stem cell;     growth/differentiation;     tissue engineering;     gene therapy

   肌腱缺损往往需要用肌腱移植修复，然而， 自体肌腱移植供区有限、并发症多、异体移植则可引起排异反应及疾病传播等［1］。人工肌腱可引起炎症反应、固定失败等并发症。组织工程技术为肌腱缺损的修复开辟了新的途径，但其修复肌腱缺损的临床效果仍难尽如人意［2，3］，突出的问题是多数组织工程化肌腱力学性能不能满足临床需要，与宿主组织间有非正常界面，组织再生过于缓慢，影响早期活动和功能康复等。因此，现有肌腱组织工程技术仍需某些改进。 目前这一领域的研究主要集中在寻找和使用功能活跃的种子细胞，利于组织长入的支架材料和促进细胞分化与成熟的细胞因子等方面［2～4］。

    1     种子细胞

    种子细胞是肌腱组织工程的一个先决条件，细胞的组织来源应充足，应具备在体外快速增殖的能力，不引起排异反应和疾病传播等［4,5］。肌腱细胞是肌腱组织工程理所当然的种子细胞，诸多研究表明，肌腱细胞，尤其是自体腱细胞为基础的肌腱组织工程技术可成功替代常规肌腱修复技术，然而其一些固有的缺陷，如来源有限，有供区并发症，获取的细胞数量低，细胞增殖慢，体外扩增时间长等限制了这一细胞的使用［5］。因此，寻找其他来源功能活跃的细胞便显得十分重要。已有作者对几种类型的细胞进行了研究，其中干细胞可能成为肌腱组织工程的理想种子细胞。干细胞有两种类型，即成人干细胞和胚胎干细胞。胚胎干细胞是全能的，但是，它的使用受到伦理和细胞调节方面的制约。成人干细胞，也被称做间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC)，尽管在潜能上与胚胎干细胞相比有明显的区别，其仍具备极好的再生能力，能在培养中快速增殖，能分化成多种细胞类型。因其使用没有伦理问题，在逻辑上对于组织工程更为适用。有研究表明成人骨髓源间充质干细胞具备分化成腱细胞的能力［6］。兔骨髓源 MSCs植入I型胶原中能促进肌腱修复，可显著改善肌腱的组织结构、生物力学性能和功能［7］。异体骨髓源 MSCs 植入编织的聚乳酸复合聚乙醇酸中（poly?lactide?co?glycolide,PLAGA),用于桥接兔的跟腱缺损，术后观察12周，MSC组的组织形成、塑型率、抗张力强度均显著优于对照组。将MSCs 用绿色荧光基因标记后植入兔髌腱缺损，结果显示植入的MSCs可在肌腱修复处存活8周以上。尽管上述研究肯定了骨髓源MSCs在肌腱组织工程中的作用，但是，骨髓的获取有一定的并发症，所得的细胞数量低（大约每105个贴附的基质细胞仅有1个为MSC），需要较长时间的体外扩增，不仅花费高，还有污染及细胞丢失的可能。近期的研究表明，粗制脂肪组织含有一定的成人干细胞，其在体外能向成骨、脂肪、软骨或肌肉方向分化；相对于骨髓，其获取容易，所得细胞数量大，引起的并发症少，使得这一细胞很符合未来肌腱组织工程及细胞治疗的需要。有作者将大鼠腹股沟部来源的脂肪源的MSCs用荧光基因标记后植入大鼠跟腱缺损处，术后1～28 d，用无损伤IVIS (in vivo image system)和FITC标记的第二抗体检测到荧光基因的表达和大量移植的MSCs。尽管有大量证据表明MSCs在肌腱组织工程方面有很好的应用前景，但移植细胞的效能，与周围组织融合的机理，细胞在体内的信息传递及分化等仍需进一步研究；适当的毒研究以阐明其在体内长期的安全性仍有必要。广泛使用干细胞治疗还有赖于发现和使用新的技术手段，以便能够大量培养、储存和运送细胞［8］。

    2     支架

    生物相容性支架是肌腱组织工程的另一个前提条件，在这方面有许多材料可供选择，包括材料，如I型胶原、人和牛硬脑膜、小肠粘膜下层等，和各种各样的合成材料， 如聚乙醇酸poly(glycolic acid)(PGA)、聚乳酸poly(lactic acid)(PLA)、及其共聚物PLAGA、聚丙烯等。合成生物降阶材料具有生物相容性、市场可售等优点，对其研究日见增多［2,8,9］。它们可被制作成具有不同孔隙、不同结构、不同力学和降阶属性的三维支架， 并已在肌腱组织工程领域取得了不同程度的成功。然而，合成支架可能会改变被修复组织的力学性质，随时间而丧失其强度及完整性，不利于肌腱长入，引起周围组织磨损，加重炎症反应，引起不必要的增生，从而在修复段周围形成瘢痕等。因此，在其替代自然材料之前仍需某些改进［8，9］。然而，目前没有一个通用的标准来预测培养的细胞在多聚物表面粘附、增殖、扩展的情况。成纤维细胞在PLAGA上的粘附依细胞来源、类型的不同而有所变化，折射出不同的软组织细胞类型有着特定的表面需求，因此，在选取合适的多聚物用于肌腱组织工程之前，其表面与细胞的相互作用，尤其是其立体和化学结构对细胞活性、生长、功能的影响应首先得到研究。有相当数量的研究表明，细胞外基质（extracellular matrix,ECM) 为多孔隙的纤维结构，有紧密相连的胶原纤维构筑而成，而胶原纤维由纳米纤维丝构成。在体内细胞粘附并排列在比细胞直径小的纤维上。因为ECM对于组织再生有深刻的影响，理想的组织工程支架就应模仿ECM的结构和功能，因此，合成的纳米三维基质结构应能为组织工程提供十分优越的条件。电纺丝技术能直接高效廉价地生产直径1 nm～1 um的纤维［9］。通过优化条件，其电喷射能将聚合物溶液制作出不同直径、不同形态的纳米纤维，收集器上纤维的沉积和随机排列构成了纳米纤维基质。各种各样的合成和自然材料已被电纺成纳米纤维，如PGA、PLA、PLAGA［5,9,10］。近来的一些细胞培养证实了不同的细胞类型，比如，成骨细胞、成纤维细胞、MSCs和肌肉细胞能在纳米基质上粘附和增殖。 有作者通过控制电纺过程中的参数，用PLAGA制作出管状纳米纤维支架，其力学强度和耐缝合能力均达到肌腱修复的要求，用其桥接大鼠1 cm跟腱缺损，支架材料逐渐被新生组织取代，最终难以与周围肌腱区别［8］。

    3     生长因子

    近年来，一些研究集中在利用各种生长因子促进肌腱再生方面，包括：血小板源生长因子(PDGF) 、上皮细胞生长因子(EGF) 、成纤维细胞生长因子（FGF) 、胰岛素样生长因子－I(IGF-I) 、骨形态发生蛋白（BMPs)2-7、生长分化因子(GDFs)5-7、和TGF1-3等［1,8,11］。体内外研究表明，生长因子能促进细胞增殖和蛋白合成，而肌腱损伤用生长因子治疗后力学性能增强。然而，生长因子在损伤部位会逐渐消失或丧失功能，引出了生长因子的浓度、稳定性、以及其在组织再生中的作用效果问题。一些缓慢和控制生长因子释放的系统似乎对组织的修复有利，但其未必能将生长因子以有效浓度维持至足够长的时间［8,11］。

    基因转染技术能通过持续表达外源性基因而在修复处维持生长因子局部的浓度。载体能将外源基因带入靶细胞并得以表达，载体分为病毒性和非病毒性。病毒性载体是丧失了复制能力的病毒，外源性的遗传物质可以插入其中。 因其能将它们的遗传物质引入宿主细胞并成为正常生命周期的一部分，故这些载体效能高。 非病毒载体，如脂质体，致病性低，因为缺乏病毒蛋白质，其将DNA转入细胞的能力比病毒性载体弱［12,13］。用载体进行基因转染的方法有2种［14］：(1)体内（直接）转染，即用载体直接施加于相关组织；(2)体外（间接）转染，即将细胞移到体外进行基因转染，经过一定的中间环节，包括细胞培养，将其再重新引入靶器官。直接基因转染较之于体外转染侵袭性小，操作简单，其可用于损伤的早期治疗。其缺点是，可能对损伤邻近区域的细胞造成非特异的感染。还有，由于有细胞外基质，细胞相对匮乏，需要的载体要具备高度的转染能力，以便在体内能转染足够数量的细胞［8,14］。有作者将携带Lac-z标记基因的质粒注射入大鼠的跟腱内，在注射部位检测到转染的细胞。将携带lacZ基因的重组腺病毒注射到鸡的肌腱内，转染基因在肌腱中可稳定表达75 d以上，转染率与病毒剂量呈正相关。将腺病毒重组BMP-2基因直接转染完全损伤的鸡肌腱，修复肌腱的抗张力强度增加了2倍。 腺病毒系统的优点是：(1)能将外源性基因插入停止分裂的细胞；(2)腺病毒携带的基因副本独立于宿主细胞DNA之外，避免永久插入宿主染色体中；(3)重组腺病毒可在体外扩增到很高的滴定度。因为肌腱和腱鞘的细胞为分裂不活跃的细胞，使用外源基因的目的是在肌腱损伤愈合的起始阶段进行暂时性的治疗，腺病毒载体系统很适合肌腱损伤的治疗［12,13］。

    体外非直接技术有额外的步骤，即体外准备和培养细胞，经基因修饰的细胞在植入体内之前可先在体外进行测试， 筛选那些转染基因高表达的细胞。 细胞携带的病毒DNA不直接作用于宿主细胞，因此这种方法安全的多。由于这一技术需要大量的工作，它更适合疾病、大的组织缺损和择期手术，而不是急诊可修复的损伤［8,12］。不同种类的载体投递基因的能力不同。腺病毒在短期的试验当中是效率最高的载体，但其基因表达是短暂的，脂质体的基因转染率和表达率最低。逆转录病毒转染的成纤维细胞植入髌腱后早期有大量的转染细胞，以后转染细胞的数量随时间延长逐渐下降，但阳性细胞在植入后可存在6周以上。 用携带PDGF或IGF-1的逆转录病毒转染大鼠肩袖细胞，植入PLA支架上，修复肩袖撕裂。结果表明PDGF和IGF-1转染促进腱细胞胶原和DNA的合成，能使完全撕裂肌腱的组织结构恢复正常［14］。

    基因治疗为基础的肌腱组织工程虽然尚处于起始阶段，其在治疗肌腱损伤方面已取得了一些令人鼓舞的进展［15］。现在面临的挑战是进一步界定理想的靶细胞，甄别有治疗价值的基因和筛选合适的载体，在成功投递基因的同时，把副作用降到最低，把效能发挥到最大。还需要寻找损伤小，更有效的技术手段，将这些载体植入肌腱损伤处。另外，因为许多用于治疗的基因产品可能会产生严重的副作用，在用于人的研究以前，有必要先在大型动物身上建立长期安全性和效能的追踪记录。

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