泛素连接酶与肿瘤关系的研究
【关键词】 泛素 连接酶 肿瘤
目前认为，真核细胞内的蛋白质主要通过两种不同的蛋白酶解系统降解：溶酶体途径和泛素?蛋白酶途径。其中，约80%通过泛素?蛋白酶体途径降解。泛素连接酶是泛素?蛋白酶体系统的重要成分，它在癌形成过程中扮演着重要的角色[1]。本文从细胞周期、凋亡、肿瘤等方面来介绍泛素连接酶与肿瘤发生和治疗的关系。
1 泛素连接酶与泛素?蛋白酶体系统
1.1 泛素化与蛋白降解
泛素?蛋白酶体系统成分复杂，主要包括泛素、泛素激活酶、泛素结合酶、泛素连接酶、 蛋白26S酶体等。泛素化是一种蛋白质翻译后修饰形式，是泛素结合至靶蛋白的过程，是泛素?蛋白酶体系统进行蛋白降解必需步骤。泛素?蛋白酶体系统降解蛋白的过程如下：泛素激活酶（E1）利用以ATP形式存在的能量，与泛素结合形成高能硫酯键，即E1的半胱氨残基与泛素的C末端甘氨酸残基形成高能硫酯键，构成泛素?E1耦联物并将泛素激活。然后通过转酯作用将活化的泛素转移到泛素结合酶（E2）的活性半胱氨酸残基上，接着E2将活化的泛素转移至相应泛素连接酶（E3）上形成高能量E3泛素耦联物，E2也可以直接将泛素转移到靶蛋白的Lys残基上，但一般靶蛋白的泛素化需要一个特异的泛素连接酶E3，最后E3可直接或间接地促使泛素转移到特异靶蛋白，使泛素的C末端羧酸酯与靶蛋白赖氨酸的ε?氨基形成异肽键，或转移到已与靶蛋白相连的泛素上形成多聚泛素链，重复直到靶蛋白质上连接的多个泛素形成一条短链。靶蛋白与多个泛素共价结合后被蛋白酶复合体识别并降解。
1.2 泛素连接酶及其类型
泛素连接酶是泛素与靶蛋白结合所需要的第三个酶，它选择性地识别并结合特异的靶蛋白，决定了其在泛素介导的降解靶蛋白底物的选择性方面的重要作用。根据识别靶蛋白序列中结构域不同，E3可分为两大类型：⑴、HECT 结构域（homologous to E6?AP C terminus，HECT）家族的泛素连接酶（HECT E3s）：HECT泛素连接酶有一个分子量约40kDa的羧基末端催化结构域，即HECT结构域。HECT结构域包含带有保守的半胱氨酸残基的350个氨基酸，该结构域上的半胱氨酸残基通过硫酯键与泛素形成共价中间体将泛素传递给底物；HECT泛素连接酶的N末端不具有保守性，容易变化，可能是决定底物的特异性识别。HECT E3s 有Smurf2，E6?AP，ARF? BP1等；⑵、RING (the Really Interesting New Gene，RING)结构域家族的泛素连接酶（RING E3s）： RING结构域家族最典型的特点是具有环指结构域，也是该家族具有泛素连接酶作用的重要因素；RING结构域的氨基酸序列为：Cys?X2?Cys?X9?39?Cys?X1– 3?His?X2 –3?Cys/His?X2?Cys?X4–48?Cys?X2?Cys，其中X为任何氨基酸，每一环指结构域连有两个锌离子。RING E3s的泛素连接酶活性依赖于此环指结构域，并通过其以支架连接泛素结合酶与底物，介导泛素从泛素结合酶到靶蛋白底物的直接传送。RING E3s包括大量成员，如：Mdm2( Hdm2)、APC、SCF、IAP、c?Cb1、Skp2等等。HECT结构域主要是通过与泛素形成催化作用所必需的硫酯键发挥作用，而RING结构域为E2和底物提供居留位点从而使E2催化泛素转移到底物上。
2 泛素连接酶与肿瘤的关系
2.1 泛素连接酶在肿瘤组织中表达
资料表明，一些泛素连接酶异常调节与肿瘤发生密切相关。Adhikary等通过组织芯片技术研究HectH9（ARF?BP1）在人类实体瘤表达情况，发现HectH9在29例肺癌有18例表达、72例乳腺癌有31例表达、15例胰腺腺癌有3例表达、131例大肠癌组织有68例表达，表达高于它们相对应的正常组织，提示HectH9在这些癌组织过度表达[2]。Hdm2正常情况下表达很弱，但是在乳腺癌、软组织肉瘤、食管癌、肺癌、成胶质细胞瘤和恶性黑色素瘤中或因基因扩增、或转录增加、或翻译增多而过表达，另外，Hdm2高表达水平常还与预后不良相关：或是增加远处转移，或是耐药[3]。大量证据显示Skp2在人类几乎所有的癌症中过表达，并且与细胞周期依赖激酶抑制蛋白P27表达呈负相关，与预后不良相关[4]。这些说明泛素连接酶与肿瘤有密切相关，进一步研究有可能成为肿瘤生物标志物或肿瘤治疗靶点。
2. 2 泛素连接酶与肿瘤发生的关系
2.2.1 泛素连接酶与细胞周期的关系
泛素介导的蛋白质降解在维持细胞周期调控因子水平中起着重要作用。SCF泛素连接酶复合物主要参与G1/S期调控因子的泛素化降解，当SCF泛素连接酶调控异常将导致细胞异常增殖、癌变[5]。Skp2结合c?Myc，促使c?Myc泛素化和降解，同时促进c?Myc诱导细胞周期S期转化并激活c?Myc靶基因[6,7]。APC(Anaphase promoting complex)发生异常会使细胞周期调控失常而发生肿瘤。研究表明APC的两个亚单位APC6/CDC16和APC8/CDC23常在人类结肠癌中发生突变而失活[8]。ARF?Bp1具有泛素连接酶活性，通过泛素化Myc限制肿瘤细胞生长速度，用RNA干扰技术敲低肿瘤细胞株U2OS和Hela cells的ARF?Bp1表达，能下调多种Myc靶基因表达，同时造成细胞周期停滞在G1期中[2]。
2.2.2 泛素连接酶在DNA修复中的作用
在许多类型细胞中抑癌基因P53是DNA损伤诱导的细胞周期阻滞的重要调节者。P53蛋白水平的调控是通过泛素介导的蛋白质降解途径实现，泛素连接酶E6?Ap，Mdm2等都可以促进P53的泛素化降解。ARF过表达直接与Mdm2相互作用并抑制Mdm2促使P53蛋白降解。Chen等用RNA干扰和转基因技术研究ARF与泛素连接酶ARF?BP1关系中发现ARF可通过ARF?BP1调控P53蛋白水平[9]。如果P53正常的调控系统发生异常，引起P53蛋白降解过度，将造成肿瘤的发生。BRCA1蛋白具有泛素连接酶活性，在DNA修复过程中发挥重要的功能。DNA复制中发生的内源性错误或暴露于基因毒性试剂都可以通过对BRCA1/BARD1进行翻译后修饰而直接激活其泛素连接酶活性，进而其连接酶活性使其对DNA损伤产生适当的反应，从而增加基因组的稳定性最终达到抑制肿瘤形成的作用。BRCA1异常将会发生肿瘤，如乳腺癌、卵巢癌都有BRCA1突变[10]。
2.2.3 泛素连接酶在凋亡中的作用
自从1990年Schwartz LM等首次将泛素与细胞凋亡联系起来后，越来越多研究资料表明，泛素在细胞凋亡过程中的重要性，在细胞凋亡的每一时期都有泛素?蛋白酶体降解途经参与。IAP(Inhibitors of Apoptosis)家族具有泛素连接酶的活性[11]，可以直接结合并抑制起始和效应caspases分子，对线粒体及Fas介导的凋亡均有抑制作用。XIAP（X?chromosome?linked inhibitor of apoptosis）是IAP家族成员之一，可以直接抑制caspases 功能和多途径调节细胞凋亡，XIAP表达与急性骨髓性白血病预后有很强的相关性。在前列腺癌细胞株LNCap中，过度表达的XIAP通过降低Caspase?3活性，抑制Caspase?3前体的加工而抑制taxol诱导的凋亡[12]。Chen等用RNA干扰技术沉默人骨肉瘤细胞株（U2OS）、乳腺癌细胞株（MCF?7）、肺腺癌细胞株（A549）中的ARF?BP1基因表达，能稳定P53蛋白表达水平，诱导癌细胞凋亡，其中U2OS有32.3%细胞发生凋亡[9]。
2.3 泛素连接酶在肿瘤中的地位
Chen等研究ARF?BB1与ARF关系中发现用RNA干扰技术灭活ARF?BP1活性能稳定P53蛋白水平并诱导凋亡，同样在不表达P53的癌细胞或P53突变的乳腺癌细胞中灭活ARF?BP1可引起细胞生长停滞[9]。Adhikary等发现不管P53蛋白表达状况如何，RNA干扰技术敲低ARF?BP1表达能抑制肿瘤细胞增殖，认为抑制ARF?BP1功能可能是一种新的干预Myc致瘤功能的药途径[2]。一种Hdm2 泛素连接酶抑制物HLI98小分子家族复合物能抑制Hdm2活性，随之引起P53蛋白增多，肿瘤细胞生长停滞，凋亡增多[13]。Shibahara等用乙酸苯酯处理前列腺癌细胞后，Skp2表达水平降低，P27水平升高，导致细胞增殖停滞[14]。在非小细胞肺癌细胞中，腺病毒介导XIAP靶向的反义核酸能降低XIAP蛋白表达，增加癌细胞对放疗、化疗的敏感性。这些表明ARF?Bp1、Hdm2、Skp2等泛素连接酶E3均有可能或可以作为相关肿瘤治疗的药物靶点，说明了泛素连接酶作为肿瘤治疗靶点的可行性。
3 展 望
泛素连接酶通过调控蛋白质的泛素化过程参与细胞内的多种生理功能，包括细胞生长，DNA修复和凋亡，其异常调控将会导致肿瘤的发生和。泛素连接酶还决定泛素介导的蛋白酶体降解途径底物的特异性。随着泛素连接酶作用机制的进一步的阐明，泛素连接酶将有益于肿瘤的诊断和治疗。
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