诱生型一氧化氮合酶和内皮素?1在内毒素休克家兔血管反应性变化中的作用

【摘要】  目的 了解诱生型一氧化氮合酶(iNOS)和内皮素?1(ET?1)在内毒素休克后家兔血管反应性变化中的作用。方法 家兔128只，随机分为3组：脂多糖(LPS)对照组(n=48)，氨基胍(AG)+LPS组(n=40)，PD?142893+LPS组(n=40)。LPS对照组再分为6亚组：正常对照组、给LPS后0.5、1、2、4、6小时组(n=8)，测各组肠系膜上动脉(SMA)、腹腔动脉(CA)和左肾动脉(LRA)的血管反应性及组织iNOS、ET?1mRNA水平。AG+LPS组和PD?142893+LPS组均再分为5亚组：正常对照组、给LPS后1、2、4、6小时组(n=8)，测各组SMA、CA、LRA的血管反应性。结果 内毒素休克早期CA的血管收缩和舒张反应性增加要多于SMA和LRA，且CA组织iNOS mRNA水平升高明显高于SMA和LRA，而3根血管ET?1mRNA水平均无明显变化;休克晚期SMA和LRA的血管收缩和舒张反应性的丢失均要多于CA，且SMA和LRA血管组织中iNOS和ET?1mRNA水平升高要高于CA。使用AG和PD?142893抑制iNOS和ET?1后各血管的反应性得到明显恢复。结论 内毒素休克后iNOS和ET?1在各器官血管的差异表达可能参与了血管低反应性器官差异的形成。

【关键词】  内毒素休克;血管反应;一氧化氮合酶;内皮素?1;氨基胍

　　Abstract： Objective To explore the roles of inducible nitric?oxide synthase (iNOS) and endothelin?1 (ET?1) in the changes of vascular reactivity following endotoxic shock in rabbits.Methods The 128 rabbits were divided into 3 groups：lipopolysaccharide(LPS) control group(n=48),LPS+aminoguanidine(AG) group(n=40),LPS+PD?142893 group(n=40).LPS control group was further divided into 6 sub?groups: normal control,0.5,1,2,4,6 hours after LPS injection.The superior mesenteric artery (SMA),celiac artery (CA) and left renal artery(LRA) from each animal were adopted to assay the vascular contractile and relaxing reactivity and the mRNA expression of iNOS and ET?1.LPS+AG group and LPS+PD?142893 group both were further divided into 5 sub?groups: normal control,1,2,4,6 hours after LPS injection.The vascular reactivity of SMA,CA and LRA was determined.Results The increase of contractile reactivity and relaxing reactivity of CA was more than that of SMA and LRA in the early stage of endotoxic shock,and the expression level of iNOS mRNA of CA was higher than that of SMA and LRA,while the expression of ET?1 mRNA of the three arteries had no significant changes.The loss of contractile reactivity and relaxing reactivity of SMA and LRA was more than that of CA in the late stage of endotoxic shock,and the expression level of iNOS and ET?1 mRNA of SMA and LRA was higher than that of CA.Vascular reactivity was significantly improved by inhibiting iNOS and ET?1 expression.Conclusion The organ differential expression of iNOS and ET?1 may contribute to the organ diversity of vascular hyporeactivity.

　　Key words:endotoxic shock;vascular reactivity;iNOS;endothelin?1;aminoguanidine

　　内毒素休克是严重创伤失血及其它临床危重病的一种常见并发症，且是导致此类患者死亡的重要原因之一。研究表明，内毒素休克在失代偿期存在血管低反应性[1，2]，血管低反应性的存在严重影响休克的效果。内毒素休克后血浆一氧化氮(NO)和内皮素?1(ET?1)水平显著升高，休克晚期NO的生成主要由诱生型一氧化氮合酶(iNOS)催化，iNOS、ET?1的组织表达显著升高[3，4]。本实验室前期研究发现，内毒素休克后肠系膜上动脉(SMA)、腹腔动脉(CA)和左肾动脉(LRA)对去甲肾上腺素(NE)、乙酰胆碱(Ach)的反应性存在器官差异[5]。但是iNOS和ET?1在各血管组织的表达如何，它们是否参与了内毒素休克后血管低反应性器官差异的发生，目前尚不清楚。为了阐明这一问题，本实验采用家兔脂多糖(LPS)静注内毒素休克模型，研究了给LPS前后各时相点SMA、CA和LRA组织中iNOS和ET?1mRNA的表达水平，及iNOS特异性抑制剂氨基胍(AG)和ET?1受体非选择性抑制剂PD?142893对内毒素休克后血管反应性的影响。

        材料与方法

　　1 主要试剂及仪器

　　脂多糖(LPS E.coli O111B4 美国Sigma公司)，RNA保存液(荷兰Qiangen公司)，Tripure裂解液(美国Roche公司)，DEPC(美国BBI公司)，Ver3.0 RT?PCR试剂盒、琼脂糖(日本 Takara公司)，Goldview核酸染料(Tiangen公司)，氨基胍、PD?142893(美国 Sigma公司)，DU7500紫外分光光度仪(美国Beckman公司)，PTC?200型PCR扩增仪(美国BIO?RAD公司)，VDS?CL凝胶成像仪(美国Amersham Biosciences公司)。

　　2 动物模型及分组

　　普通健康成年家兔(第三军医大学大坪野战外科研究所动物中心)128只，雌雄不拘，体重2.5～2.8kg，所有家兔均于实验前12小时禁食，可自由饮水。

　　所有家兔随机分为3组，LPS对照组(n=48)，LPS+AG组(n=40)和LPS+PD?142893组(n=40)。LPS对照组又随机分为正常对照组及给LPS后0.5、1、2、4、6小时组(n=8)。内毒素休克模型通过经耳缘静脉注射LPS 1.0mg/kg复制[6]。正常组麻醉固定后不做任何处理，直接处死后取SMA、CA 、LRA，制作血管环用于血管反应性测定，同时留取部分血管组织置于RNA保存液中-70℃保存，用于RT?PCR;其余组分别于注射LPS 1.0mg/kg后0.5、1、2、4、6小时麻醉处死，留取以上标本待测。

　　LPS+AG组和LPS+PD?142893组均再随机分为正常对照组及给LPS后1、2、4、6小时组(n=8)。AG(20mg/kg)和PD?142893(0.02mg/kg)均于LPS静注后1小时给药[7，8]。各组分别于相应时刻取SMA、CA、LRA，制作血管环用于血管反应性测定。

　　3 离体血管反应性测定

　　将SMA、CA、LRA血管环挂于注有10ml Krebs?Henseleit液(NaCl 118mmol/L、KCl 4.7mmol/L、NaHCO325mmol/L、KH2PO4 1.03mmol/L、MgSO4·7H2O 0.45mmol/L、葡萄糖11.1mmol/L、CaCl22.5mmol/L、pH 7.4)的离体器官灌流槽浴槽中，持续充入95%的O2和5%的CO2混合气体，分别给予SMA、LRA、CA血管环初张力3.0、2.0、2.0g，37℃恒温孵育约100分钟，每20分钟换液1次，待张力曲线平稳后，测定血管环对梯度浓度NE(1.0×10-9～10-5、5×10-5mol/L)的收缩性，用Krebs?Hense液冲洗数次后平衡血管环40分钟，使用NE(5×10-5mol/L)预收缩后测定血管环对梯度浓度Ach(10-9～10-5mol/L)的舒张性，以张力/血管环重量(g/mg组织)为量化标准制作浓度?张力曲线，用血管环对NE的最大收缩反应和对Ach的最大舒张反应及浓度?张力曲线评价血管反应性。

　　4 RT?PCR检测iNOS和ET?1mRNA水平

　　使用Tripure裂解液提取SMA、CA、LRA标本的总RNA，紫外分光光度法测定RNA纯度和浓度，要求A260:A280比值为1.8～2.0。逆转录前RNA统一定量为0.5μg。β?actin、iNOS和ET-1的引物序列通过获得[9-11]，引物由大连宝生物公司合成。引物序列及PCR条件见表1。取iNOS/ET?1PCR产物2μl、β?actinPCR产物2μl和6×上样Buffer 1μl混合，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，以目的条带和内参的总灰度之比为标准评价结果。

　　5 统计学处理方法

　　数据用±s表示，采用SPSS11.0软件进行统计学处理，组间各时相点比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。表1 β?actin、iNOS和ET?1的引物序列及PCR条件

　　引物序列产物大小(bp)退火温度(℃)循环数β?actinForward: 5'?TGCTTCAGGCGGCTGTTA?3'3146235Reverse: 5'?CGTCACATGGCATCTCAC GA?3'iNOSForward: 5'?CTG CTT TGT GCG GAG TG?3'1746235Reverse: 5'?CAC CCG AAC ACC AGG AT?3' ET?1Forward: 5'?CAAGCGGTGCTCCTGCTCCT?3'1936833Reverse: 5'?GCTCGTGCACTGGCACCT GTT?3'

　　结 果

　　1 内毒素休克家兔SMA、CA和LRA血管反应性变化

　　内毒素休克后血管收缩和舒张反应均成早高晚低的双相变化，且存在器官差异。SMA、CA和LRA对NE的收缩反应性在休克早期均不同程度增加，SMA和LRA均于LPS静注后1小时增加最多，分别增加5.6%和25.4%，而CA于LPS静注后2小时增加最多，增加23.3%;在休克晚期SMA和LRA的收缩反应性丢失比CA多，分别为34.9%、33.7%、16.2%。在休克早期，LRA和SMA对Ach的舒张反应性比CA增加早而少，分别于给LPS后0.5、1、2小时增加最多，分别增加72.3%、26.2%、307%;在休克晚期CA的舒张反应性仍呈高反应(增加159%), 而SMA和LRA 呈低舒张反应(分别丢失32.3%和30.5%)(图1)。

　　2 内毒素休克家兔SMA、CA和LRA组织iNOS和ET?1 mRNA表达水平

　　SMA组织iNOS和ET?1 mRNA的表达水平在早期均没明显变化(P>0.05)，晚期(4、6小时)显著升高(P<0.05)，4小时达峰值，分别升高94.9%、81.3%(图2a,d)。

　　CA组织iNOS mRNA表达水平在1小时开始显著升高(P<0.05)，4小时达峰值，升高47.7%;而ET?1 mRNA表达水平在早期没有明显变化(P>0.05)，在4小时开始明显升高，6小时达峰值，升高38.7%(图2b,e)。

　　LRA组织iNOS和ET?1 mRNA的表达水平在早期均没明显变化(P>0.05);在晚期均明显升高(P<0.05)，分别于4小时和6小时达峰值，分别升高45.2%和46.1%(图2c，f)。

　　3 AG、PD?142893对内毒素休克后SMA血管反应性的影响

　　与LPS对照组相比，AG处理后，SMA对NE的收缩反应性在给LPS后2、4小时没有明显变化，在给LPS后6小时明显升高;其对Ach的舒张反应性在给LPS后2、4小时明显下降，给LPS后6小时没有明显变化。PD?142893处理后，SMA对NE的收缩反应性在给LPS后2小时没有明显变化，在给LPS后4、6小时明显升高;其对Ach的舒张反应性没有明显变化(图3)。

　　4 AG、PD?142893对内毒素休克后CA血管反应性的影响

　　与LPS对照组相比，AG处理后，CA对NE的收缩反应性在给LPS后2、4小时明显下降，而在给LPS后6小时明显升高;其对Ach的舒张反应性在给LPS后2、4小时明显下降，在给LPS后6小时没有明显变化。PD?142893处理后，CA对NE的收缩反应性没有明显变化;其对Ach的舒张反应性在给LPS后2小时明显下降，给LPS后4、6小时没有明显变化(图4)。

　　5 AG、PD?142893对内毒素休克后LRA血管反应性的影响

　　与LPS对照组相比，AG处理后，LRA对NE的收缩反应性在给LPS后2小时没有明显变化，在给LPS后4、6小时明显升高;其对Ach的舒张反应性在给LPS后2、4小时明显下降，在给LPS后6小时没有明显变化。PD?142893处理后，LRA反应性与AG处理组呈相似变化(图5)。

　　图1 内毒素休克家兔SMA、CA和LRA对NE(a)和Ach(b)的Emax变化。Emax为最大收缩/舒张力 a、b和c分别代表SMA、CA和LRA的iNOS和ET?1的mRNA表达的电泳图;d、e和f分别代表SMA、CA和LRA的iNOS和ET?1 mRNA表达的柱状图。与正常组比较:*P<0.05

　　图2 内毒素休克家兔SMA、CA和LRA组织的iNOS和ET?1的mRNA表达

　　与LPS对照组比较：*P<0.05

　　图3AG、PD?142893对内毒素休克后SMA收缩(a)和舒张(b)反应性的影响

　　与LPS对照组比较：*P<0.05

　　图4AG、PD?142893对内毒素休克后CA收缩(a)和舒张(b)反应性的影响

　　与LPS对照组比较：*P<0.05

　　图5AG、PD?142893对内毒素休克后LRA收缩(a)和舒张(b)反应性的影响

       讨 论

　　本实验室前期研究发现，内毒素休克后存在血管低反应性，且血管反应性呈现双相变化和器官差异[5]。有研究表明，内毒素休克后TNF?α、IL?1、PAF大量生成，引起休克晚期iNOS的大量表达和活性增加，其引起的NO的过量生成参与了休克晚期血管收缩低反应性的发生[12-14]。内毒素休克晚期ET?1大量表达，通过与其受体ETA和ETB作用，参与了血管低反应性的发生[15-17]。本实验室前期对失血性休克的研究发现，iNOS和ET?1等血管活性因子在各器官的差异表达可能参与了休克后血管反应性器官差异的表达[8,18]。内毒素休克后iNOS和ET?1在各器官的表达呈现怎样的变化，其是否参与了休克后血管反应性的变化，目前尚无相关报道。因此本研究观察了内毒素休克后各血管组织iNOS和ET?1mRNA表达水平的变化规律及AG和PD?142893对休克后血管反应性的影响。

　　本实验发现，SMA血管组织iNOS和ET?1 mRNA的表达水平在内毒素休克晚期均显著升高，与内毒素休克晚期的收缩和舒张反应性均成负相关。使用AG和PD?142893拮抗iNOS、ET?1后，内毒素休克晚期的收缩低反应性得到部分改善，进一步证明了内毒素休克晚期iNOS和ET?1的高表达可能参与了血管收缩低反应性的发生。但是应用AG或PD?142893后，内毒素休克晚期的舒张低反应性没有得到明显改善，推测内毒素休克晚期舒张低反应性的发生除NO、ET?1参与外，可能还有其它因素的参与。

　　CA血管组织iNOS的表达水平在给予LPS后1小时显著升高，一直持续到给予LPS后4小时，给予LPS后6小时表达下降，其与内毒素休克后早期对NE的高收缩反应性呈正相关，与内毒素休克后舒张反应性亦呈正相关。使用AG抑制iNOS后休克早期的高收缩反应性被部分削弱，晚期的收缩低反应性被部分恢复，内毒素休克后的早期高舒张反应性显著降低。ET?1表达水平在内毒素休克晚期显著升高，其与内毒素休克晚期血管收缩反应性呈负相关，使用PD?142893后内毒素休克晚期血管低反应性没有明显改善，可能与PD?142893使用剂量及时间有一定关系。

　　LRA血管组织iNOS表达水平在内毒素休克晚期显著升高，与休克晚期收缩低反应性呈负相关，使用AG后内毒素休克晚期的收缩低反应性部分恢复，说明休克晚期iNOS的高表达可能参与了休克晚期收缩低反应性。ET?1的表达水平在内毒素休克后晚期显著升高，与休克晚期收缩低反应性负相关，使用PD?142893后内毒素休克晚期的血管收缩低反应性部分恢复，说明休克晚期ET?1的高表达可能参与了休克晚期收缩低反应性。

　　上述结果说明，内毒素休克后iNOS和ET?1的表达变化与血管反应性的器官差异变化具有一定的关系，且进一步研究发现，iNOS、ET?1的拮抗剂均能改善内毒素休克后的血管低反应性。提示iNOS、ET?1可能参与了休克后血管反应性的调控，在休克晚期的血管反应性变化中起着更为重要的作用，各血管的表达差异可能参与了血管低反应性的器官差异发生。

【】
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