脾脏切除对实验性脑损伤大鼠生存率及血液脑组织中IL?1β含量的影响
作者：李梅，吴国材，李飞，张礼均，陈志，张项，单佑安，林江凯，朱刚，尹志勇，冯华
【摘要】 目的 观察脾脏切除对实验性脑损伤大鼠死亡率、血液中白细胞介素?1β(IL?1β)的浓度以及致伤区脑组织IL?1β mRNA含量的影响，为提高重型颅脑创伤患者救治水平探讨新思路。方法 成年雄性SD大鼠随机分为3组：颅脑创伤假手术+脾切除假手术组(A组)，颅脑创伤+脾切除假手术组(B组)和颅脑创伤+脾切除组(C组)。采用Feeney自由落体法对大鼠右顶叶致伤，观察各组大鼠致伤后7天内死亡率(nA=23，nB=65，nC=65);ELISA法测定致伤后6、12、24小时、2天及3天时大鼠血液中IL?1β的浓度(各时相点nA=nB=nC=6);荧光定量PCR法检测致伤后6、12、24小时、2天及3天时致伤区域脑组织IL?1β mRNA的含量(各时相点nA=nB=nC=3)。结果 致伤后7天内大鼠A、B、C组死亡率分别为0%，38.46%及16.92%，各组间比较均具有显著差异(P<0.05);ELISA检测发现致伤后2天及3天时B组IL?1β显著增高，A、B及C组分别为：184.3±31.6、355.3±58.1(P<0.01)及140.4±29.5，109.4±16.7、1205.6±128.8(P<0.01)及165.0±20.1;荧光定量PCR检测发现，B、C两组致伤侧脑组织IL?1β mRNA含量均出现先显著升高、后下降的趋势，但C组较B组下降明显。结论 颅脑创伤大鼠于伤后行脾脏切除能够显著降低大鼠死亡率，对血液及创伤区域脑组织中IL?1β的产生均有一定的抑制作用。
【关键词】 颅脑损伤;脾脏切除;死亡率;白细胞介素?1β;大鼠
Abstract： Objective To observe the effect of splenectomy on the mortality and IL?1β concentration in blood and its mRNA content in traumatic brain tissue of rats with experimental brain trauma,so as to provide effective clinical management for severe traumatic brain injury patients.Methods Adult male SD rats were divided into 3 groups randomly: sham operation on brain and spleen(group A),experimental brain trauma & sham operation on spleen(group B),and experimental brain injury & splenectomy(group C).Modified Feeney's method was used to create the animal model of experimental brain trauma.Mortality within 7 days following the experiment was calculated(nA=23，nB=65，nC=65),and IL-1β concentration in blood at 6,12,24 hours,2 days,and 3 days after experiment was examined by ELISA(nA=nB=nC=6);fluorescent quantitation of IL?1β mRNA was also determined.Results The mortality within 7 days after experiment in group A,B,and C was 0%,38.46%,and 16.92% respectively(P<0.05，significant difference was observed between groups): at day 2,IL?1β concentration in group A,B,and C was 184.3±31.6,355.3±58.1(P<0.01),140.4±29.5 respectively;at day 3,109.4±16.7,1205.6±128.8(P<0.01),165.0±20.1 respectively;IL?1β mRNA content was highly increased at 6 hours after experiment and then decreased in both group B and C.Conclusion Splenectomy after experimental brain trauma in rat could effectively reduce its mortality,and could inhibit IL?1β expression in some level.
Key words:brain trauma;splenectomy;mortality;IL?1β;rats
颅脑外伤的致残率和死亡率都很高，其中重型颅脑创伤的死亡率仍高达30%以上[1]。继发性脑水肿是患者死亡的关键原因之一，各种前炎症因子的释放如白细胞介素?1β(IL?1β)等与继发性脑水肿有着密切关系[2]。脾脏是人体最大的免疫器官，机体在应激状态下能够释放多种炎症介质，在炎症反应中发挥重要作用;但一些研究表明，炎症因子的释放能够加重颅脑损伤的程度[3]。本实验旨在明确实验性大鼠颅脑创伤后行脾脏切除对其死亡率的影响，并探讨脾脏切除对血液中IL?1β浓度及脑组织中IL?1β mRNA 含量的变化，初步阐明其作用机制。
材料与方法
1 材料
清洁级健康成年雄性SD大鼠(200～250g，2～3月龄,购于第三军医大学大坪动物中心)。室温25℃，相对湿度70%，昼夜照明12h/12h;大鼠白细胞介素?1β(IL?1β)ELISA试剂盒(上海西唐，96孔板)，酶标测试仪(BIO?RAD，Model 550);DEPC(罗氏公司)，Tris碱(北京鼎国)，氯仿(成都市科龙化工试剂厂)，异丙醇(成都市科龙化工试剂厂)，RT?PCR试剂盒(TOYOBO公司)，2×Taq PCR Master Mix(北京天根公司)，50bp Marker(背景天根公司);GAPDH引物(上海生工生物工程有限公司合成)，低温离心机(Sigma公司)，荧光定量PCR仪(ABI 7500)，分析软件PCR System 9700(Applied BioSystems)。
2 方法
2.1 实验动物分组 SD大鼠随机分为3组：颅脑创伤假手术+脾脏切除假手术组(A组，对照组)，颅脑创伤+脾脏切除假手术组(B组)和颅脑创伤+脾脏切除组(C组)。实验前8小时禁食，不禁水;观察大鼠致伤后死亡率的实验中，A组：n=23，B组：n=65，C组：n=65;酶联免疫吸附法(ELISA)测定致伤后6、12、24小时、2、3天各时相点大鼠血清中IL?1β的浓度，每个时相点各组大鼠n=6;荧光定量实时PCR法测定致伤后6、12、24小时、2、3天各时相点致伤侧脑组织中IL?1β mRNA表达情况，每个时相点各组大鼠n=3。
2.2 动物模型的制备 颅脑致伤：参照Feeney法[4]建立大鼠实验性重型颅脑创伤模型。以1%戊巴比妥钠按照40mg/kg进行肌肉麻醉，颅顶部脱毛、消毒;将大鼠固定于立体定向仪上，正中切口开颅，以牙科钻在冠状缝后3mm与矢状缝右侧3mm交会处钻孔，扩大骨窗至6mm×6mm(前至冠状缝，左界为矢状缝右旁2mm)，保持硬膜完整;将重30g的圆柱状打击杆(打击端直径4.5mm)沿垂直固定于立体定向仪上的套管内自20cm高度释放，打击中心即为钻孔点;以明胶海绵局部止血，至无活动性出血后间断缝合头皮。对照组(A组)只开骨窗不进行打击。
脾脏处理：将大鼠仰卧固定与手术台上，左侧腹部消毒、铺巾，于左侧肋缘下端中点为起点，向下作长约2.5cm切口，逐层打开腹腔，轻提脾脏，结扎脾脏血管，并将脾脏取出。A、B组大鼠仅将脾脏轻提至腹腔外再放回腹腔即可。分层缝合肌肉、皮肤。
2.3 ELISA法测定致伤后不同时间大鼠血液中IL?1β的浓度
2.3.1 取材：将大鼠麻醉，开胸从心脏抽血，待血液静置30 分钟后，12000g离心10分钟，取上清，保存于-20℃待检测。
2.3.2 IL?1β浓度检测：按IL?1β ELISA检测试剂盒说明进行，于酶标仪上在450nm处测吸光值，以标准品浓度建立标准曲线，样本中IL?1β的浓度。
2.4 荧光定量PCR测定致伤侧脑组织IL?1β mRNA表达量
2.4.1 取材：将大鼠断头处死，完整取出致伤侧大脑半球，清洗血凝块，修剪组织只保留致伤边缘2mm;将组织放入液氮中保存。
2.4.2 荧光定量实时PCR：总RNA提取及鉴定：取约30～50mg脑组织于液氮中研磨至粉状，酚氯仿法提取组织总RNA;紫外分光光度仪检测提取总RNA的质量和浓度，所有RNA样品A260/A280均在1.7～2.0范围内。逆转录(RT)cDNA的合成：按照TOYOBO公司逆转录试剂盒操作，逆转录(20 μl体系)包括：5×RT Buffer 4.0μl，RNA Ace 0.5μl，RNase Inhibitor 0.5μl，dNTPs 2.0μl，Oligo(dT) 1.0μl。反应条件：(20μl体系置PCR仪内反应)42℃—10分钟→30℃—20分钟→99℃—5分钟→4℃→5分钟。荧光定量实时PCR：IL?1β及GAPDH(内标)引物均由上海生工合成。IL?1β引物序列：F 5'CGTGGCACATTCTGGTCAAA 3'，R 5'CTCGTGACCCCCCTGAATC 3';GADPH引物序列：F 5'ACCCATCACCATCTTCCAGGAG 3'，R 5'GAAGGGGCGGAGATGATGAC 3';反应体系总共20μl，包括：cDNA 2.0μl，GADPH?1 0.5 μl，GAPDH?2 0.5μl，2×Mix Taq 10.0 μl，H2O 7.0μl。反应条件设置：(1)预热：94℃，5分钟，一个循环;(2)扩增：94℃30秒;55℃30秒，72℃30秒;共35个循环;(3)退火：72℃，10分钟。取15μl PCR产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳，5v/cm，应用图像采集及分析软件PCR System 9700对电泳条带进行分析处理，IL?1β表达量用其条带校正容积与GAPDH校正容积之差的对数值表示，其中以6小时时相点中的A组标本为对照。
3 统计学处理
本实验数据采用SPSS 11.5软件进行处理，各组数据均以均数±标准差(±s)表示，多组样本间均数比较采用One?Way ANOVA进行分析，P<0.05认为差异具有统计学意义。
结 果
1 各组大鼠致伤后早期死亡率的观察
B、C两组大鼠致伤后均出现不同程度的神经功能障碍，精神差、进食少、活动少，左侧肢体瘫痪、颈部支撑头部困难、头向左偏、夹尾刺激后出现逆时针旋转等;A组大鼠均无神经功能障碍，观察B、C两组大鼠死亡均发生在致伤后7天内，7天后罕有死亡，故采用致伤后7天计算各组大鼠死亡率(见表1)。表1 各组大鼠致伤后7天内死亡率统计
2 各组大鼠致伤后不同时相点血液中IL?1β浓度的测定
A组及C组大鼠血液中IL?1β的浓度呈现出先逐渐升高，至致伤后24小时为高峰，然后逐渐降低，至伤后3天已经降至伤后6小时水平;而B组大鼠血液中IL?1β的浓度则逐渐上升，至伤后3天已经高达1200pg/ml，与其他各组比较均具有统计学意义(图1)。
与A组比较：*P<0.05，**P<0.01;B、C两组比较:##P<0.01
图1 致伤后不同时相点各组大鼠血液中IL?1β的浓度3 各组大鼠致伤后不同时相点致伤侧脑组织中IL?1β mRNA含量的变化
以致伤后6小时的A组标本为对照组，其余各组所测得的IL?1β mRNA含量均与之相比较，所得数值(设为n)即代表是A组标本中IL?1β mRNA含量的n倍。结果显示，致伤后6小时开始B、C两组大鼠致伤侧脑组织IL?1β mRNA含量均急剧增加，且C组在早期显著高于B组;后均有所下降，但C组下降幅度明显较B组大(图2)。
讨 论
研究发现，脾脏能够通过释放炎症介质促进炎症因子级联瀑布反应，加重机体继发性损伤的程度，尤其是对脾脏在急性胰腺炎病理过程中的作用研究较多[5,6]，目前尚无其在重型颅脑外伤中作用的相关报道。因此，我们对实验性脑创伤大鼠行脾脏切除，观察其对大鼠生存率的影响，以及对IL?1β这一重要的炎症介质在血液中及致伤侧脑组织中含量的影响，探求脾脏切除对脑创伤大鼠的作用及可能机制。
本实验结果显示，对实验性脑创伤大鼠于伤后行脾脏切除能够使伤后7天的死亡率从38.46%降低至16.92%，两者之间具有显著差异，首次发现伤后行脾脏切除对脑创伤大鼠有积极的保护作用。为尽量排除其他因素的干扰，本实验选用健康清洁级SD大鼠，排除了雌激素脑保护作用[7]的干扰;大鼠的月龄及体重基本一致，随机分组，饲养场所温度、湿度等均为相同条件。实验结果提示，颅脑创伤后，脾脏参与并加重了其病理过程;而严际慎等[6]对急性胰腺炎大鼠进行研究发现，正常大鼠较预先行脾切除大鼠的胰腺病理改变明显严重，证实脾脏在急性胰腺炎过程中有一定影响，脾切除能够减轻或阻止其病程的发展;同样说明脾脏可能加重应激后的病理反应程度。
研究表明，脑损伤后多种细胞因子如IL?1β、IL?6、TNF?α等明显增加[8-11]，参与了脑损伤后的病理过程，其中尤其以IL?1β的作用相对较为显著。正常情况下中枢神经系统仅有少量的IL?1β及其受体表达，创伤后IL?1β表达显著增高并与继发性脑水肿的形成密切相关。朱刚等[12]研究发现，脑创伤后伤侧脑组织IL?1β明显增加并伴有脑水肿形成，应用IL?1β特异性抗体后能够明显抑制创伤后脑水肿的发生;Lloyd等[13]也得出了同样的结论。本研究结果显示，行脾切除的C组大鼠血液中IL?1β的含量与假手术对照组变化趋势基本一致，并且除了在伤后6小时时显著低于对照组(A组)外，其他各时间点均与对照组没有显著差异;而B组的大鼠伤后血液中IL?1β的含量呈现出逐渐递增的趋势，且于伤后2、3天时均显著高于A组及B组，说明颅脑创伤后能够通过脾脏释放IL?1β，参与炎症反应过程;而创伤区域血脑屏障的损伤也使IL?1β能够达到致伤的脑组织局部，可能进一步加重了脑组织的炎症反应。
荧光定量实时PCR结果显示，致伤后早期，B、C两组大鼠致伤局部脑组织的IL?1β mRNA含量均显著增高，且后者也显著高于前者;其后均呈下降趋势，但C组下降的速度较B组明显，至伤后3天已降至基本和A组持平;而B组降低速度较缓慢，至伤后3天时仍显著高于A组。Harting等[8]研究利用大鼠皮质损伤模型，分别对其伤后6、12、24、48及72小时时致伤区域的脑脊液进行研究发现，IL?1β等细胞因子的含量于伤后早期即显著增加，与我们的研究结果相符合。结合血液中IL?1β含量的ELISA实验结果，我们推测致伤后早期，致伤区域脑组织的IL?1β主要是由局部炎症细胞激活后产生，但其产生的量会逐渐降低，而随后脾脏即参与到脑创伤后的病理过程，于伤后2天左右开始使血液中致炎因子IL?1β等显著增加，这些致炎因子透过血脑屏障到达受损区域脑组织，参与局部炎症反应，使得继发性脑水肿的程度加重，最终导致脑疝;而脾脏切除后正是消除了这一作用，使得其死亡率显著下降。
综上，脾脏切除能够显著降低颅脑创伤大鼠的死亡率，对血液中IL?1β有一定抑制作用;而未行脾切除的颅脑创伤大鼠，脾脏则通过过度分泌IL?1β加重炎症反应，可能是其加重病情、增加死亡率的重要机制。脾脏切除对颅脑创伤大鼠保护效应的具体机制需要进一步的研究证实，从而为重型颅脑创伤患者的临床救治提供新的思路与途径。
【】
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