载万古霉素?羟基磷灰石抗感染钛钢板的研制
作者：唐良华，赵长虹，潘长江，王远亮，王爱民
【摘要】 目的 探讨一种携载并缓释万古霉素（VCM）的抗感染骨折内固定钢板的制备；并通过扫描电镜(SEM)、X射线能谱仪(EDX)、红外光谱分析仪（FT?IR）等检测其特征、抑菌实验检测其对金黄色葡萄球菌抑制作用等，期望能为临床上预防以及开放性骨折手术后的细菌感染提供一种途径。方法 以羟基磷灰石（HA）为载体，采用仿生溶液（Simulated body fluid，SBF）生长法（Biomimetic growth），在钛合金板基体表面制备了携载VCM的HA抗感染涂层，通过SEM，EDX和FT?IR等检测方法对钛钢板表面涂层进行检测；选用金黄色葡萄球菌（S.aureus）作为试验菌，分别观察载VCM-HA缓释钛钢板和载HA钛钢板的体外抗菌效果。结果 钢板表面获得载VCM?HA涂层；抑菌试验证明，钢板周围出现明显抑菌圈，表明VCM被成功携载于涂层中。结论 载VCM?HA钛钢板能有效的携载万古霉素，且保持了其抑菌活性。
【关键词】 万古霉素 羟基磷灰石 钢板仿生溶液 金黄色葡萄球菌 涂层
Abstract:： Objective To explore the preparation of an internal fixation plate which can inhibit infection by carrying and slow?releasing vancomycin.By detecting inhibition of staphylococcus aureus in vitro，we hope to provide a way to prevent and treat bacterial infection after surgery of open fractures.Methods HA coatings which carry vancomycin were prepared on the surface of titanium plate substrate for fracture fixation by simulated body fluid technology with the HA as a carrier；vancomycin?HA loaded plates were detected by the test method of SEM，EDX and FT?IR；Bacteriostasis of vancomycin?loaded HA plates and blank HA plates were observed with staphylococcus aureus as test organisms.Results The vancomycin?HA loaded coatings were prepared on the plates.The test of bacteriostasis indicated that obvious inhibition zone appeared around the plate.It showed that vancomycin was successfully loaded on the coating.Conclusion Vancomycin?HA loaded plates for internal fixation carries vancomycin effectively and keeps their bacteriostatic activity.
Key words：vancomycin；hydroxyapatite(HA)；plate staphylococcus aureus；biomimetic method；simulated body fluid；coating
抗生素缓释系统是近20年来在一系列新的生物相容性较好的无机材料和有机高分子材料基础上逐渐起来的，为解决目前常规用药方式效率不高且毒性较大这一缺陷的一种新型局部给药方式，在治疗骨髓炎、骨结核和感染性骨缺损等方面有着广阔的应用前景。目前国外有少量学者探索载抗生素涂层的克氏针、髓内针、钢板等进行骨折后抗感染的治疗。Gollwitzer等［1］尝试以聚D，L?乳酸（PDLLA）为缓释载体的载庆大霉素或替考拉宁缓释克氏针，置入2.5×105cfu/ml金黄色葡萄球菌悬液中，与裸露的不锈钢、钛合金或克氏针比较明显减少了吸附的细菌数量（P<0.01）。Schmidmaier等［2］使用的含有庆大霉素和PDLLA涂层的胫骨髓内钉已经得到欧洲和加拿大的CE检验通过，且部分患者已经通过此种方法进行治疗，其中8例开放性胫骨骨折已经用含有庆大霉素和PDLLA涂层的非扩髓髓内钉治疗，随访1年后，8例均无感染。而羟基磷灰石（HA）具有良好的生物相容性和可降解吸收性，骨外科上可用作内固定材料。若能将内固定材料与缓释系统结合起来，则使局部用药治疗感染的效果能够得到大大提高。考虑到以上原因，本实验采用仿生溶液生长技术在钛合金板上沉淀有缓释特性、可降解的HA来承载万古霉素，从而制出具有抗菌特性的钛合金钢板。使此种钢板具有在骨折愈合过程中能够发挥强力的抗菌性能，起到预防和治疗感染的双重作用，为开放性骨折和火器伤提供早期的较好的治疗措施。
材料与方法
1 材料和试剂
医用钛合金钢板（1.5cm×1.0cm×0.5cm，第三军医大学大坪提供），盐酸万古霉素（稳可信，ELI Lilly Japan K.K），金黄色葡萄球菌（ATCC 25923，第三军医大学微生物实验室提供），丙酮、乙醇、HCl、H2SO4等实验用试剂均为分析纯。
2 载万古霉素?HA（VCM?HA）涂层的制备
2.1 按照进行磷酸盐缓冲液（PBS）、仿生溶液（SBF）和1.5 SBF的配制 精确称取NaCl 8g，KCl 0.2g，NaHPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g溶解于800ml蒸馏水中，调节pH 7.40，再定容至1000ml，即制成本实验中使用的PBS。
参照Kokubo等［3］的方法，在800ml蒸馏水中依顺序加入NaCl 7.996g，NaHCO3 0.350g，KCl 0.224g，K2HPO4·3H2O 0.228g，MgCl2·6H2O 0.305g， CaCl2 0.278g，Na2SO4 0.071g，用50mmol/L缓血酸胺（CH2OH）·3CNH2和0.1MHCl缓冲pH值7.40，温度37℃，定容至1000ml，即制成本实验中使用的SBF。配制后的离子终浓度与人体血浆离子浓度几乎相同。同法配制1.5倍SBF（1.5SBF离子浓度为SBF离子浓度乘以1.5倍而成）。SBF、1.5SBF和人体血浆的成分组成见表1。
表1 SBF、1.5SBF和人体血浆的成分组成（略）
2.2 对钛板进行机械处理，使金属表面活化 将所有钛板用400# 、600#金相砂纸打磨，然后分别于双蒸水、丙酮、70%乙醇、超纯水中分别超声清洗15分钟，取出，烘干；放入盛有1∶1的18 wt% HCl和48 wt% H2SO4混合液中，经酸处理30分钟后，再放入60℃ 6N NaOH溶液中处理24小时，取出后用双蒸水充分冲洗，40℃下烘干；放入DRZ?5?10实验电炉控制器（重庆华能电炉耐火材料厂）中进行加热处理（600℃，1小时）。
2.3 制备载VCM?HA涂层和载HA涂层 将样品放入盛有30ml SBF溶液的小塑料瓶中，置于37℃恒温摇床缓慢摇动。2天后取出样品，双蒸水冲洗、风干后分为二组分别放入盛有30ml 1.5SBF溶液的小塑料瓶中，一组按60mg/100ml加入万古霉素，一组不加万古霉素。继续于37℃恒温摇床缓慢震荡，每2天更换1次1.5 SBF溶液和万古霉素，连续放置7天后取出，自然风干。
3 SEM，EDX和FT?IR的检测
所有样品使用TESCAN扫描电镜（SEM，OXFORD；England）观察样品表面涂层形貌、X射线能谱仪（EDX，OXFORD，England）分析涂层的元素组成；表面复合层结构的鉴别则利用Fourier transform infrared SpectrumGX红外光谱分析仪（FT?IR System，Perkin Elmer，USA）进行。
4 体外抑菌性能测定
将钛块制作成直径7mm，厚5mm的圆片，按上法生产出载VCM?HA和载HA缓释钛钢板。将载VCM?HA缓释钛钢板和载HA缓释钛钢板各3个经环氧乙烷消毒后，分别放入6个均匀涂有1.5×108cfu/ml的金黄色葡萄球菌（S.aureus）的MH琼脂培养皿中，37°C培养24小时后测量抑菌圈大小。
结果
载VCM?HA钛板上有淡白色雾状涂层，而不载VCM?HA钛板上则无白色雾状涂层，颜色呈灰蓝色。
1 SEM检测结果
使用SEM（20Kv）观察样品表面涂层形貌。由图1a、b可见钢板表面形成了涂层，表面形成高低起伏、大小不一的球状结构（大小10～30μm），且结构致密，而图1c中则显示为完全钛表面结构。
2 EDX检测结果
通过EDX进行元素分析。环境模式与SEM分析相同。裸钛板主要是钛元素，其峰很高，还有少量氧和碳元素（图2a）。而载VCM?HA钛板中则钛峰明显降低，主要是钙和磷元素，同样有氧和碳元素，在2KeV附近可见磷峰，在接近4KeV处可见钙峰，钙、磷峰大大超过钛峰，且钙峰比磷峰高；钙、磷的原子比为1.67（图2b）。
3 FT?IR检测结果
将载VCM?HA钛板和载HA钛板上的涂层分别刮下约1mg后，加入300mg溴化钾中进行磨制，然后用YP?2压片机（上海山岳仪器有限公司）在20MPa的压力下压制成厚约1mm，直径约为10mm左右的透明片子进行FT?IR检测，分辨率为2cm-1，扫描范围在4000cm-1～400cm-1（见图3）。
图3中其涂层相结构为HA［4］。图3a、b中均出现了P?O和P?OH谱带，这主要是来自羟基磷灰石中的磷酸根，图中PO43-的峰在563、602、873，961、1038cm-1都出现了，在961cm-1为 PO43-ν1带，在1038cm-1为为PO43-ν3带，在563和602cm-1为为PO43-ν4带。另外图3a中未见万古霉素的特征峰，a、b两图无明显差异，可能是涂层中载药量较少，故仪器未能检测出来。
4 抑菌结果
为验证肽板中VCM的抗菌作用，我们选用金黄色葡萄球菌（植入物相关感染的主要致病菌之一［5］）为试验菌，分别对载VCM-HA缓释钛钢板和载HA缓释钛钢板进行体外抑菌性能比较。通过观察抑菌效果发现，载VCM?HA钛钢板的培养皿中出现了明显的圆形抑菌圈，经游标卡尺测量，抑菌圈平均直径达到了4.20mm。而载HA缓释钛钢板没有出现抑菌圈。
图1 （略）
a、b.载VCM?HA钛板；c.祼钛板
图2 （略）
a.祼钛板；b.载VCM?HA钛板
图3 （略）
a.载VCM?HA钛板；b.载HA钛板
讨论
临床上四肢骨折或骨折内固定手术后，其中并发症之一为术后感染，据AO组织2006年报道，开放性骨折中感染率约为3%～40%［6］，如使用内固定则增加感染率30%以上。由于感染导致内固定失败，或者因为感染后形成的具有高抗药性的生物膜，即使全身应用大剂量抗生素，在病灶局部组织中亦难以达到有效的抗生素浓度，导致感染久治难愈，最终不得不取出内固定；同时还包括延长了住院期间的系统抗菌、多次清创翻修手术、治疗方案的改变、可能的截肢甚至死亡等。如美国每年200万院内感染病例中有一半与内植入物有关［7］，造成110亿美元的损失；英国每年内植入物的感染造成700～1100万英镑的损失［8］。而在战时火器伤中，由于组织损伤和污染严重，在弹道周围0.5cm以内有大量细菌存在，即使经过清创后骨及软组织的感染率仍高达25%～40%［1］，如使用内固定则感染率增加30%以上［7］。可是使用外固定具有针道感染率高（5.9%～19%）、钢针松动和不便于早期功能锻炼、不便于护理等缺点，因此研究一种本身具有抗菌功能的内固定材料，也许是解决这个问题的一个好办法。
羟基磷灰石（hydroxyapatite）的化学式为Ca10（PO4）6（OH）2，简称HA，属六方晶系，晶格参数为a=b=0.9421nm，c=0.6882nm，Ca/P原子比为1.67。HA广泛存在于动物的骨和牙中，也存在于人体的一些病态组织（如唾液结石、脑结石、尿道结石、扁桃体石、结节结石和颈椎后韧带骨化）之中，占人骨成分的77% ， 齿骨中更是高达97%［9］。HA具有良好的生物相容性和骨引导能力，但缺乏骨诱导能力，其力学性能较差，而钛及其合金具有密度较小（接近于人骨）、比强度高、耐腐蚀性好、良好的生物相容性等优点。因此，常把HA涂覆在力学性能较好的生物惰性金属表面如钛或钛合金的表面，得到兼有两者优点的复合材料。
本实验选用的VCM属于糖肽类抗生素，直接作用于细菌细胞壁前体羧基末端的D?Ala?D?Ala（D?丙酰胺?D?丙氨酸），抑制细胞壁蛋白的合成，对革兰氏阳性菌有强效的杀灭作用，是治疗耐甲氧西林表皮葡萄球菌和耐甲氧西林金葡菌感染的特效药物。由于其全身引用会造成较严重的肝、肾等重要脏器的损害，因此被认为是较理想的的局部应用的抗生素之一，若能制成载万古霉素涂层的钢板进行开放性骨折的治疗，对于在开放性骨折和战时火器伤中应用前景光明。
纯金属基体由于无生物活性，因此很难在其表面上生长出HA涂层。通常需要对金属表面进行预处理，如通过溶胶?凝胶法［10］、酸蚀?碱水侵蚀法［11］等在表面预形成金属氧化物层，从而能与溶液作用形成HA涂层。近几年起来的在金属或其他基体上仿生沉积磷灰石的方法，模仿了界生物磷灰石的矿化机制，磷灰石层是在类似于人体环境条件的水溶液中自然沉淀出来的。仿生溶液生长法是先配制一种与人体体液组成几乎相同的溶液SBF，然后将金属基体置于此溶液中，模仿自然界生理磷灰石的矿化机制，在金属基体表面上生长出HA涂层（图1a、b，图2）。其基本原理为［12，13］：先对金属基体进行碱液预处理，在其表面形成金属氧化物层，同时配制与人体体液组成几乎相同的模拟体液SBF （表1）；然后将金属基体材料置入用于磷灰石晶核化介质的SBF溶液中，在SBF溶液中钛表面磷灰石的核化称为诱导期；而1.5 SBF溶液对磷灰石高度过饱和，是磷灰石晶核生长的介质，金属基体材料置入后，磷灰石晶核在原位自发生长形成涂层，称为生长期；由此在仿生物环境条件下，金属基体材料表面金属氧化物层与模拟体液作用形成羟基磷灰石涂层，其主要是含Ca，P的涂层（图2、3）。仿生沉积的磷灰石层具有如下的优越性［14］：（1）由于仿生磷灰石层的成分更接近于人体骨无机质，而可望具有高的生物相容性和骨结合能力；（2）在低温下进行，为共沉积蛋白质等生物大分子提供了可能性；（3）可在形状复杂多孔的基体上形成均匀的涂层；（4）工艺简便，费用较低。通过此法，为研制载抗生素?HA涂层的内固定物提供了简易可行、低成本的制作方法。
【】
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