N?乙酰半胱氨酸对大鼠颅脑损伤后ICAM?1和NF?κB表达的影响

【摘要】  　　目的 观察N?乙酰半胱氨酸（NAC）对大鼠颅脑损伤后细胞间黏附因子?1（ICAM?1）和核转录因子?κB(NF?κB)表达的影响，探讨其脑保护机制。方法 90只Wistar大鼠随机分为假手术组(n=6)、颅脑创伤组(n=42)及颅脑创伤NAC干预组(n=42)。采用自由落体法建立大鼠颅脑创伤模型，应用免疫组织化学法检测NF?κB和ICAM?1表达的变化。结果 与假手术组相比，脑损伤组NF?κB和ICAM?1表达水平明显升高，NAC可降低NF?κB和ICAM?1表达，减轻炎症反应。结论 NAC可能通过抑制NF?κB和ICAM?1的表达，减轻炎症反应，发挥脑保护作用。

【关键词】  颅脑损伤 N 乙酰半胱氨酸 核因子 κB 细胞间黏附因子 1
　　Abstract：  Objective  To explore the effect of NAC on NF?κB and ICAM?1 expression after traumatic brain injury(TBI) in rats,and discuss the mechanisms of neuro?protection by NAC.Methods  Ninety adult male Wistar rats were randomly divided into sham group(n=6),TBI group(n=42) and NAC group(n=42).The experimental TBI model was established by Feeney's method.Samples were obtained after injury for inspecting the expression of ICAM?1 and NF?κB proteins by immunochemical method.Results  Compared with the sham group, the expression levels of ICAM?1 and NF?κB were significantly increased after traumatic brain injury,and NAC significantly decreased the expression of ICAM?1 and NF?κB.Conclusion  Expression of NF?κB and ICAM?1 decreased by NAC might be one of the mechanisms in regulating ICAM?1,NF?κB level and inhibiting inflammation in cortex and exerting protective function to neurons.
   
　　Key words：brain injury;N?acetylcysteine(NAC);NF?κB;ICAM?1
   
　　研究表明脑损伤后适量的核转录因子(NF?κB)表达水平可抑制神经细胞凋亡，具有脑保护作用，但其过度激活常导致其它炎性细胞因子的过度表达，导致严重的继发性脑损害［1，2］。细胞间黏附因子?1（ICAM?1）可介导多种炎症细胞黏附于血管内皮细胞，是多种炎性因子发挥作用的分子基础［3］，同时ICAM?1的表达又受到包括NF?κB在内的多种因子的调节。N?乙酰半胱氨酸(NAC)是一种含有巯基的还原剂，具有稳定细胞膜、保护细胞活性和清除活性氧等作用［4］，在减轻心、脑、肝等脏器的缺血再灌注损伤中的作用日益受到关注，而在创伤性颅脑伤中的作用研究较少，本试验旨在观察NAC对大鼠颅脑损伤后伤侧脑组织内NF?κB和ICAM?1表达的影响，探讨有关的作用机制，以期为临床提供理论依据。

　　材料与方法

　　1  主要仪器、试剂和实验动物
   
　　Dympus DP70成像系统，Image?proplus 5.0(IPP5.0)数据分析系统，NAC（Sigma公司），大鼠立体定向仪(江湾Ⅱ型,上海)，ICAM?1多克隆抗体（兔抗）（北京博奥森生物技术有限公司）；NF?κB p65(F?6)：sc?8008(鼠抗)（Santa Cruz公司），二步法免疫组化试剂盒(抗鼠和抗兔IgG  PV?6001/6002)、SP试剂盒和DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；3月龄健康雄性Wistar大鼠，SPF级，体重(260±20)g（甘肃省中医学院动物实验中心提供）。

　　2  实验动物分组及模型制备
   
　　随机分为假手术组(sham组，n=6)、颅脑创伤组（TBI组，n=42）及NAC干预组（NAC组，n=42），后2组分别分为3、12、24、48、72小时、5、7天组，每组6只。采用改良Feeney's自由落体硬膜外撞击法制作颅脑损伤模型［5］，致伤冲击力为1000g/cm。假手术组除不打击外，其它步骤同创伤组。NAC干预组于颅脑损伤后立即经腹腔注入NAC150mg/kg， 颅脑创伤组于伤后经腹腔注射等量生理盐水。大鼠清醒后笼中饲养，自由进食水。

　　3  标本采集与检测
   
　　Sham组于伤后24小时取材，余2组在伤后相应时间点分别取材。将大鼠深度麻醉后固定于动物实验台上，剪开胸腔，以生理盐水150ml和4%多聚甲醛150ml先后经左心室灌注固定，同时剪开右心耳。之后完整取出脑组织，冠状切取损伤灶处具有完整皮层的组织固定、石蜡包埋，4μm连续切片备用。免疫组化采用SP法测定NF?κB表达水平、采用二步法测定ICAM?1的表达，一抗均按1：150稀释，分别严格按SP和二步法试剂盒说明书操作。
   
　　免疫阳性染色细胞和血管显微镜下表现为深黄色或棕褐色。在Dympus DP70成像系统高倍光学显微镜下（×400），每张切片任选6个非重叠高倍视野进行观察，对ICAM?1免疫染色血管进行计数并平均值，NF?κB免疫组化染色标记强度用光密度值(optical density,OD)表示，比较各组OD值。

　　结果

　　1  ICAM?1表达的变化
   
　　ICAM?1免疫阳性染色表现为深黄色或棕褐色，主要定位于血管内皮细胞，且主要集中在皮层血管，脉络丛只有少量免疫染色血管（图1a、b和c、d）。NS对照组伤后3小时即可见免疫染色血管开始增多，12小时明显增多，72小时小时达到高峰，之后开始下降，7天时可见明显下降。与sham组相比，TBI组和NAC组3小时组阳性血管数虽有升高，但均无统计学意义（P>0.05），余各时间点均明显增高，有非常显著性差异（P<0.01）；NAC组与TBI组相比，3小时组免疫阳性血管数无明显减少（P>0.05），12小时和7天组时，免疫阳性血管数减少，有显著性差异（P<0.05），24、48、72小时和5天组可见免疫阳性血管数明显减少，有非常显著性差异（P<0.01)（见图2）。

　　2  NF?κB蛋白表达的变化
   
　　NF?κB阳性染色定位于胞浆和(或)核膜，呈黄色或棕黄色(图1e、f和g、h)。颅脑损伤后3小时在伤侧脑组织中即可见NF?κB表达，12小时表达明显升高，24小时达高峰，后表达水平逐渐下降，与sham组比较均有非常显著性差异(P<0.01)；NAC治疗组伤后NF?κB表达自3小时即明显下降，与损伤12、24、48、72小时组相比，NF?κB表达显著下降，差异非常显著(P<0.01)，与损伤5天和7天组相比差异显著(P<0.05)(见表1)。
   
　　a、b.分别为TBI组的24小时和72小时组伤侧脑组织ICAM?1的表达变化；c、d.分别为NAC组相应时间点ICAM?1的表达变化(如箭头所示)；e、f.分别为TBI组的24小时和48小时组伤侧脑组织NF?κB的表达变化；g、h.分别为NAC组相应时间点NF?κB的表达变化(如箭头所示)

　　图1  颅脑损伤后ICAM?1和NF?κB表达变化(SP  ×400)（略）
   
　　与TBI组相比：*P<0.01,@P<0.05；与Sham组比较：#P<0.01,$P>0.05 ；与sham组和TBI组比较：**P>0.05

　　图2  NAC对大鼠颅脑损伤后不同时间点伤侧脑组织ICAM?1表达的影响（略）

　　表1  NAC对大鼠颅脑伤后不同时间点伤侧脑组织NF?κB表达的影响（略）

　　与TBI组比较：*P<0.01，ΔP<0.05；与sham组相比：＃P<0.01

　　讨论
   
　　抗氧化剂NAC具有直接清除氧自由基作用，其脱乙酰基后成为谷胱甘肽合成的前体，能增加细胞内谷胱甘肽的水平，增强组织的抗自由基作用，并能稳定细胞膜结构，稳定谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶，保持其活性，并对诱导型氧化氮合酶mRNA的表达有抑制作用，进而减少NO的产生［6］。本研究结果显示,NAC干预可以减轻局灶性脑损伤的炎性反应，减少脑组织NF?κB及ICAM?1的表达，提示NAC可能通过调节NF?κB及ICAM?1对脑损伤起到神经保护作用。
   
　　创伤性脑损伤后的继发性脑损害与很多因素有关，炎症反应能够促进继发性损害，是继发性脑损伤的主要原因之一［7］。NF?κB是炎症反应的一个重要信号转导分子，在脑损伤的炎症反应中起中心环节的作用［8］，能诱导炎症因子的表达与凋亡。在正常情况下，大多数细胞中NF?κB与其抑制因子IκK、IκB蛋白结合，滞留于细胞浆中，而不能转入细胞核内，因此不具有转录性。颅脑损伤后，多种原因引起NF?κB与其抑制蛋白脱离后转入细胞核内进而被激活，发挥其对多种炎症因子的调节作用。本试验在脑创伤NAC干预后，损伤侧脑组织内NF?κB在核内的表达水平明显降低，其可能机制为NAC可能通过促进NF?κB与其抑制因子IκK、IκB蛋白结合，从而抑制NF?κB活化，这就阻止了多种炎症递质基因上调，减轻脑损伤的炎症反应。另外，活化的NF?κB可直接调控参与脑损伤后炎性损伤的包括ICAM?1在内的多种炎性介质的表达。
   
　　ICAM?1是中枢神经系统中细胞表达最广泛的黏附分子，几乎所有的脑细胞均有ICAM?1的表达,有跨膜及可溶性蛋白(sICAM?1)两种形式。颅脑损伤后在脑组织内表达水平明显上升，可介导多种炎症细胞黏附于血管内皮细胞，特别是脑损伤的急性期，此时多种炎性细胞因子表达增加，其白细胞介素?1（IL?1）、白细胞介素?6（IL?6）、白细胞介素?8（IL?8）、肿瘤坏死因子?α（TNF?α）和干扰素?г等主要促进水肿和炎症反应，而黏附分子则是它们发挥作用的分子基础［9］。研究显示［10］，许多炎性因子可直接或间接使ICAM-1在炎症反应中表达上调，其中首推NF?κB，其次为TNF?α、IL?6、IL?8、IL?1β等许多炎性因子。NF?кB是参与炎症反应调控的重要核转录因子。近年来研究表明［11］，NF?κB能够结合到ICAM?1基因的启动子上,使其表达上调，促进缺血区白细胞浸润，诱导缺血性脑损伤。许多炎性因子又可通过NF?κB来调控黏附因子的基因表达。本试验中发现，脑损伤后NF?κB表达高峰先于ICAM?1表达高峰，说明高水平的NF?κB表达可能启动了ICAM?1的基因表达上调，从而上调了ICAM?1的表达水平；而当NAC干预后，NF?κB表达高峰明显降低，ICAM?1表达高峰也明显降低，说明NAC可能通过降低NF?κB的表达，继而使ICAM?1表达减少；也可能NAC通过其抗氧化作用直接降低ICAM?1的表达水平，从而减少其炎症反应的介导作用，减轻脑损伤后的继发性损害，发挥脑保护作用。
   
　　综上所述，NAC可能通过自身的抗氧化作用和清除氧自由基等特性，抑制脑损伤后NF?κB的表达,继而下调ICAM?1的表达,抑制炎症反应,对创伤性脑损伤起一定程度的保护作用。但最近研究显示［12］，脑损伤后一定水平的NF?κB的活化向核内易位后，可增加抗凋亡因子（survivin）的合成和分泌，从而阻断细胞凋亡过程，发挥脑保护作用。因此，我们且莫盲目过分抑制脑损伤后NF?κB的表达活性，NF?κB可能为“双刃剑”的角色，即过度的表达可能促进严重的继发性炎性脑损伤，而一定水平的表达可能通过其阻断凋亡过程，发挥脑保护作用。所以，如何应用NAC调节NF?κB的表达活性，以达到生物效应平衡状态，发挥其最大的脑保护作用，还需进一步进行探讨。

【】
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　　［2］Yamazaki S,Muta T,Takeshige K.A novel IkappaB protein,IkappaB?zeta,induced by proinflammatory stimuli,negatively regulates nuclear factor?kappaB in the nuclei［J］.J Biol Chem,2001,276(29):27657-27662.

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