CPI?17、ILK、ZIPK与PKCα、ε在低氧大鼠血管平滑肌中的相互作用

                作者：徐竞，明佳，李涛，杨光明，陈玮，刘良明 

【摘要】  目的 本实验室前期研究发现蛋白激酶Cα（protein kinase Cα,PKCα）、蛋白激酶Cε（protein kinase Cε,PKCε）可能通过改变CPI?17（PKC?potentiated inhibitory protein for protein phosphatase 1 of 17kDa）、ILK（integrin?linked kinase）、ZIPK（zipper?interacting protein kinase）的蛋白表达和活性，来调节失血性休克后血管钙敏感性，但这些分子是否存在直接相互作用，尚不清楚。本实验观察CPI?17、ILK、ZIPK与PKCα、ε在低氧血管平滑肌细胞（vascualr smooth muscle cell，VSMC）中的相互作用。方法 采用低氧培养的大鼠VSMC，运用免疫共沉淀技术，观察PKCα、ε与下游分子CPI?17、ILK、ZIPK，以及CPI?17、ILK、ZIPK之间的相互作用。结果 （1）在PKCα抗体捕获的免疫沉淀中，ILK、ZIPK抗体，尤其是ILK抗体可杂交出明显蛋白条带，CPI?17抗体不能杂交出蛋白条带；（2）在PKCε抗体捕获的免疫沉淀中，ILK、ZIPK抗体均可杂交出明显蛋白条带，CPI?17抗体不能杂交出蛋白条带；（3）在CPI?17抗体捕获的免疫沉淀中，ILK、ZIPK抗体可杂交出明显蛋白条带；在ILK抗体捕获的免疫沉淀中，ZIPK抗体可杂交出明显蛋白条带。结论 PKCα可直接作用于ILK，PKCε可直接作用于ILK和ZIPK，ILK、ZIPK可直接作用于CPI?17，ILK可直接作用于ZIPK。上述分子相互作用，形成，共同调节大鼠失血性休克后的血管钙敏感性。

【关键词】  失血性休克；钙敏感性；蛋白激酶Cα；蛋白激酶Cε；CPI?17；ILK；ZIPK

    Abstract：  Objective  Our previous research showed that protein kinase Cα(PKCα), protein kinase Cε(PKCε) regulated vascular calcium sensitivity through PKC?potentiated inhibitory protein for protein phosphatase 1 of 17kDa(CPI?17),integrin?linked kinase(ILK) and zipper?interacting protein kinase(ZIPK),while their interaction is not clear,so this research is to observe the interaction between CPI?17,ILK,ZIPK and PKCα,PKCε in vascular smooth muscle cell(VSMC) after hypoxia.Methods  The hypoxic VSMC of rats were adopted to observe the interaction between PKCα,PKCε and the downstream molecular CPI?17,ILK,ZIPK,and the interaction among CPI?17,ILK,ZIPK through co?immunoprecipitation.Results  (1)ILK and ZIPK,especially ILK,were present in immunoprecipitates of PKCα,while CPI?17 was not observed.(2)ILK and ZIPK were both obviously present in immunoprecipitates of PKCε,while CPI?17 was not either.(3)ILK and ZIPK were both obviously present in immunoprecipitates of CPI?17,and ZIPK was present in immunoprecipitates of ILK.Conclusion  PKCα interacts with ILK.PKC ε interacts with ILK and ZIPK.ILK and ZIPK interacts with CPI?17,ILK interacts with ZIPK.These molecules interact with each other and form a cooperative network contributing to regulation of vascular calcium sensitivity following hemorrhagic shock in rats.

    Key words:hemorrhagic shock;calcium sensitivity;PKCα;PKCε;CPI?17;ILK;ZIPK

     血管低反应性，主要表现为全身血管对缩血管和舒血管物质的反应降低或不反应，是严重创伤/休克患者失代偿期血压不能有效提升、组织灌注不良，加重细胞低氧和损伤，最终导致MODS和MOF的重要原因之一。本实验室前期研究发现，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）钙失敏，即肌肉收缩蛋白对钙的敏感性降低［1］，是失血性休克血管低反应性的重要发生机制之一；蛋白激酶Cα（protein kinase Cα,PKCα）、蛋白激酶Cε（protein kinase Cε,PKCε）对失血性休克后的钙敏感性和血管反应性有重要的调节作用，可通过调节CPI?17（PKC?potentiated inhibitory protein for protein phosphatase 1 of 17kDa）、ILK（integrin?linked kinase）、ZIPK（zipper?interacting protein kinase）的表达和活性，调节休克后的血管钙敏感性和血管反应性，而这些分子间是否存在直接相互作用尚不清楚。本实验采用低氧VSMC，运用免疫共沉淀技术，观察PKCα、ε与下游分子CPI?17、ILK、ZIPK，以及CPI?17、ILK、ZIPK之间的相互作用，以进一步了解休克血管钙失敏的发生机制。

      材料与方法

    1  主要试剂

    PKCα激动剂thymelea toxin、PKCα、ε抗体、ILK抗体（Sigma公司），PKCε激动剂carbachol（Merck公司），CPI－17抗体（Upstate公司），ZIPK抗体（Biomol公司），辣根过氧化物酶（HRP）结合的二抗、增强发光底物反应试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、蛋白质G琼脂糖、洗膜液（Pierce公司）。

    2  实验分组

    分离培养原代VSMC并进行低氧处理［2］，将培养的细胞随机分作4组：正常对照组即取正常VSMC；低氧2小时即将VSMC低氧2小时；低氧2小时+PKCα激动剂组即将VSMC缺氧2小时后，再加入PKCα激动剂thymelea toxin（终浓度1×10-7mol/L）孵育10分钟；缺氧2小时+PKCε激动剂组即将VSMC缺氧2小时，再加入PKCε激动剂carbachol（终浓度4×10-6mol/L）孵育10分钟。

    3  细胞总蛋白提取

    取处理好的VSMC，胰酶消化后收集细胞并转入EP管中，PBS洗涤3次，每管加入200μl蛋白提取液［50mmol/L Tris、150mmol/L NaCl、1%(V/V) Triton X?100、1mmol/L EGTA、2mmol/L EDTA、10mmol/L NaF、1mmol/L Na3VO4、1mmol/L PMSF、5μg/ml Leupeptin、5μg/ml Aprotinin、1:1000 β?mercaptoethanol］，-70℃放置10分钟，再于冰上裂解1.5小时，4℃、8000×g离心10分钟，上清即为VSMC总蛋白，并用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。

    4  免疫共沉淀和免疫印迹

    取VSMC总蛋白约500μg，加入6μg捕获抗体，4℃轻微振荡孵育24小时，然后与40μl蛋白质G琼脂糖4℃轻微振荡孵育24小时使其免疫沉淀。用蛋白提取液洗3遍，继以200×g，4℃离心5分钟。用蛋白提取液50μl溶解沉淀，100℃变性5分钟，200×g，4℃离心3分钟，取上清上样，10％SDS?PAGE胶电泳分离蛋白后，转移至硝酸纤维膜，5%封闭蛋白干粉室温封闭1小时，分别用CPI?17抗体（1:4000稀释）、ILK抗体（1:5000稀释）、ZIPK抗体（1:1000稀释）4°C孵育过夜，用HRP结合的二抗（1:10000稀释）室温孵育1小时，化学发光法胶片成像。再用洗膜液洗去一抗、二抗后，用捕获抗体（PKCα抗体1:20000、PKCε抗体1:15000、CPI?17抗体1:4000、ILK抗体1:5000）4°C孵育过夜，二抗室温孵育1小时，化学发光法胶片成像。

    5  统计学处理

    所有数据均以±s表示，两组间采用t检验进行统计学处理。P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非常显著。

    结  果

    1  PKCα与CPI?17、ILK、ZIPK的相互作用

    以PKCα抗体捕获VSMC总蛋白中的免疫沉淀物，再以CPI?17、ILK、ZIPK抗体进行免疫印迹检测，结果显示ILK抗体可杂交出明显的蛋白条带，且在休克2小时时减弱（P<0.05），在PKCα、PKCε激动剂作用下增强（P<0.01）；ZIPK抗体可杂交出轻微的蛋白条带，但在休克后和PKCα、PKCε激动剂作用下无显著性差异；CPI?17抗体不能杂交出蛋白条带，提示PKCα与ILK、ZIPK，尤其与ILK可能有直接相互作用，PKCα与CPI?17可能无直接相互作用 (图1)。

    2.2  PKCε与CPI?17、ILK、ZIPK的相互作用

    以PKCε抗体捕获VSMC总蛋白中的免疫沉淀物，再以CPI?17、ILK、ZIPK抗体进行免疫印迹检测，结果显示ILK、ZIPK抗体可杂交出明显的蛋白条带，且在休克2小时时减弱（P<0.01或P<0.05），在PKCα、PKCε激动剂作用下增强（P<0.01）；而CPI?17抗体不能杂交出蛋白条带，提示PKCε与ILK、ZIPK均可能有直接相互作用，而PKCε与CPI?17可能无直接相互作用 (图2)。

    3  CPI?17、ILK、ZIPK之间的相互作用

    以CPI?17抗体捕获VSMC总蛋白中的免疫沉淀物，再以ILK、ZIPK抗体进行免疫印迹检测，结果显示ILK、ZIPK抗体可杂交出明显的蛋白条带，且在休克2小时时减弱（P<0.01），在PKCα、PKCε激动剂作用下增强（P<0.01），提示CPI?17与ILK、ZIPK之间可能有直接相互作用。以ILK抗体捕获VSMC总蛋白中的免疫沉淀物，再以ZIPK抗体进行免疫印迹检测，结果显示ZIPK抗体可杂交出明显蛋白条带，在休克2小时时减弱（P<0.01），在PKCα、PKCε激动剂作用下增强（P<0.01），提示ILK与ZIPK间可能有直接相互作用 (图3)。图1  VSMC中PKCα与CPI?17、ILK、ZIPK的相互作用。a为电泳图片(1:正常对照组；2: 低氧2小时组；3：低氧2小时+PKCα激动剂组；4：低氧2小时+PKCε激动剂组。)b为图1a条带的光密度值分析。与正常对照组相比：*P<0.05，**P<0.01；低氧2小时组相比：#P<0.05,##P<0.01

    图2  VSMC中PKCε与CPI?17、ILK、ZIPK的相互作用。a为电泳图片(1:正常对照组；2:低氧2小时组；3：低氧2小时+PKCα激动剂组；4：低氧2小时+PKCε激动剂组。)b为图2a条带的光密度值分析。与正常对照组相比:*P<0.05，**P<0.01；低氧2小时组相比：#P<0.05,##P<0.01

    图3  VSMC中CPI?17、ILK、ZIPK之间的相互作用。a、c为电泳图片(1：正常对照组；2：低氧2小时组；3：低氧2小时+PKCα激动剂组；4：低氧2小时+PKCε激动剂组。)b、d分别为图a、c条带的光密度值分析。与正常对照组相比：*P<0.05，**P<0.01；低氧2小时组相比：#P<0.05,##P<0.01讨  论

    本实验室前期研究发现，PKCα、ε对失血性休克大鼠的血管钙敏感性和血管反应性有着重要的调节作用，并可通过调节CPI?17、ILK、ZIPK的表达和活性，来调节失血性休克血管钙敏感性和血管反应性。但PKCα、ε与下游分子CPI?17、ILK、ZIPK的关系如何，是否存在直接相互作用，尚不清楚。

    因此，本实验采用低氧VSMC，运用免疫共沉淀技术，观察分别以PKCα、ε抗体免疫沉淀后，CPI?17、ILK、ZIPK在免疫沉淀复合物中的表达。结果发现在PKCα抗体捕获的免疫沉淀中，ILK、ZIPK抗体，尤其是ILK抗体可杂交出明显的蛋白条带；在PKCε抗体捕获的免疫沉淀中，ILK、ZIPK抗体，均可杂交出明显的蛋白条带，且杂交出的蛋白条带在休克2小时时减弱，在PKCα、ε激动剂作用下增强，提示PKCα可能直接作用于ILK，PKCε可能直接作用于ILK、ZIPK。

    本实验还以CPI?17抗体免疫沉淀后，观察ILK、ZIPK在免疫沉淀复合物中的表达，以及以ILK抗体免疫沉淀后，观察ZIPK在免疫沉淀复合物中的表达。结果发现在CPI?17抗体捕获的免疫沉淀中，ILK、ZIPK抗体均可杂交出明显的蛋白条带；在ILK抗体捕获的免疫沉淀中，ZIPK抗体可杂交出明显的蛋白条带；且杂交出的蛋白条带在休克2小时时减弱，在PKCα、ε激动剂作用下增强，提示CPI?17与ILK、ZIPK之间，ILK与ZIPK之间可能存在直接相互作用。

    结合基础研究，CPI?17是一种平滑肌特异的磷蛋白，由其Thr?38位点磷酸化而活化，活化后的CPI?17发生构象变化［3］，与肌球蛋白轻链磷酸酶（myosin light chain phosphatase，MLCP）的催化亚基结合，并抑制MLCP，如同一个分子开关，启动不改变Ca2+浓度情况下的MLCP抑制、钙敏感性增高和血管收缩［4］。ILK最早发现于大鼠尾动脉和鸡胃平滑肌，是一种内源性的可引起不依赖于Ca2+浓度的肌球蛋白轻链（20kDa myosin light chain，MLC20)的Ser?18和Thr?19位点磷酸化、以及平滑肌收缩的重要激酶分子［5］。进一步研究发现ILK还可在体外以不依赖于钙离子的方式磷酸化CPI?17的Thr?38位点［6］，导致MLCP抑制和收缩增强。ZIPK即Zipper相互作用蛋白激酶，也是一种可以不依赖于钙离子的方式引起MLC20的Ser?18和Thr?19位点磷酸化、以及平滑肌收缩的重要激酶分子［7］。进一步研究还发现在血管平滑肌，ZIPK还可以作用于CPI?17，引起CPI?17的Thr?38位点磷酸化［8］。提示ILK、ZIPK均可能作用于CPI?17调节平滑肌收缩。

    综上所述，在失血性休克后的血管平滑肌，PKCα可通过直接作用于ILK，PKCε可通过直接作用于ILK、ZIPK，ILK和ZIPK再直接作用于CPI?17，同时ILK与ZIPK间存在直接相互作用。这些分子相互作用、形成，共同调节休克后的血管钙敏感性和血管收缩反应性。

【】
  ［1］Xu J,Liu LM.The role of calcium desensitization in vascular hyporeactivity and its regulation following hemorrhagic shock［J］.Shock,2005,23(6):576-581.

［2］Li T,Liu LM，Liu JC,et al.Mechanisms of Rho kinase regulation of vascular reactivity following hemorrhagic shock in rats［J］.Shock,2008,29（1）:65-70.

［3］Ohki S,Eto M,Kariya E,et al.Solution NMR structure of the myosin phosphatase inhibitor protein CPI?17 shows phosphorylation?induced conformational changes responsible for activation［J］.J Mol Biol,2001,314(4):839- 849.

［4］Toshio K,Masumi E,Terence PW,et al.Phosphorylation of the myosin phosphatase targeting subunit and CPI?17 during Ca2+ sensitization in rabbit smooth muscle［J］.J Physiol,2003,546（3）:879-889.

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