β受体阻滞剂普奈洛尔对大鼠脑创伤后脑组织中IL?1β和IL?1Ra的影响
作者：仇威富 白祥军 唐朝晖
【摘要】 目的 探讨β受体阻滞剂（普奈洛尔）对大鼠脑创伤后脑组织中白细胞介素?1β（IL?1β）和白细胞介素?1受体拮抗剂（IL?1Ra）的影响。方法 选取SD大鼠72只，随机分为对照组（36只）、组（36只）。采用改良的Feeney法致大鼠右顶叶脑创伤模型, 分别给予生理盐水、普奈洛尔腹腔注射(40mg/kg）。每组于致伤后6、24、72小时3个时相点，取右顶叶损伤区脑组织，苏木精?伊红染色（HE染色）法观察其病理变化，免疫组织化学和免疫印迹（Western blotting）方法检测其中IL?1β和IL?1Ra的表达。结果 对照组：伤后6小时即可见变性坏死神经元，且IL?1β有大量表达，24小时达高峰；IL?1Ra有极少表达并逐渐升高。 治疗组：变性坏死神经元明显减少，IL?1β表达降低；而IL?1Ra 6小时即有明显表达并持续至72小时；且IL?1β/IL?1Ra比值较对照组降低。两组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 β受体阻滞剂能明显降低大鼠脑损伤区IL?1β表达、提高IL?1Ra表达，可能对减轻大鼠脑创伤后炎性损伤具有一定作用。
【关键词】 普奈洛尔 颅脑损伤 大鼠 白细胞介素?1β 白细胞介素?1Ra
研究表明，白细胞介素?1β（IL?1β）作为一种促炎性细胞因子参与脑创伤后炎性反应［1］。Woiciechowsky等［2］研究证实β受体阻滞剂可阻断IL?1β引发的中枢神经系统炎性反应。白细胞介素?1受体拮抗剂（IL?1Ra）是脑组织中天然存在的、能降低IL?1β炎性损伤的拮抗剂。基于此，本研究旨在探讨β受体阻滞剂(普奈洛尔)对大鼠脑创伤后脑组织中IL?1β和IL?1Ra表达的影响及其机制。
材料与方法
1 实验材料
健康雄性SD大鼠72只，体重(250±20)g（购自同济医学院实验动物中心）。β受体阻滞剂选取普奈洛尔（湖北华中药业有限公司,武汉），IL?1β单克隆抗体（博士德公司，武汉），IL?1Ra单克隆抗体（Santa Cruz公司，美国）。大鼠脑立体定位仪、手术器械等。
2 动物分组与模型制作
大鼠随机分为对照组(36只)和治疗组(36只)，每组分别观察创伤后6、24、72小时3个时相点，各时相点大鼠12只，随机选取6只分别进行免疫组织化学和免疫印迹（Western blotting）实验。按改良的Feeney法（击锤重40g，底面直径约4mm，15cm高处自由落体）致大鼠右顶叶脑创伤模型。自伤前0.5小时起每日1次，治疗组给予普奈洛尔（40mg/kg）腹腔注射治疗，对照组给予等量生理盐水［3］。
3 标本采集及实验方法
3.1 SP法 大鼠经麻醉、开胸、左心室插管，4％多聚甲醛液灌注45～60分钟后取出大鼠脑组织块，石蜡包埋切片，进行苏木精?伊红染色（HE染色）观察病理变化及免疫组化观察损伤区域脑组织中的IL?1β和IL?1Ra表达变化情况。用彩色图像分析系统（HPISA?1000高清晰度彩色病理图文分析系统）对免疫组化染色的阳性细胞进行定量分析，选平均光密度（ODI）作统计指标。
3.2 Western blotting实验 （1）组织蛋白提取：大鼠麻醉后，立即断头处死，迅速取出损伤区域脑组织，剪碎后用生理盐水洗去表面血液；加入裂解液A中,浸泡5分钟,转移入二倍体积的裂解液B,电动匀浆9000转3分钟,浸泡30～60分钟。超声振荡3分钟,低温离心12000r/min,20分钟，取上清液-80℃保存,待用。（2）十二烷基硫酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS?PAGE）及转膜：取上清于10％SDS?PAGE后，将蛋白通过湿式电转移到硝酸纤维素(NC)膜上。（3）加一抗［封闭液稀释，IL?1β浓度1:400，IL?1Ra浓度1:300，β肌动蛋白（β?actin）浓度1:800，4℃孵育过夜；然后将硝酸纤维素膜置于辣根过氧化物酶（HRP）标记的相应二抗溶液中室温1小时，显色曝光。胶片条带经扫描、编辑和打印。用分析软件Bandscan4.3，对每个目的条带进行总灰度分析，β?actin为内参照，以IL?1β、IL?1Ra与β?actin的积分光密度比值代表其相对表达水平。
4 统计学处理
数据以±s表示，统计分析采用SPSS13.0统计软件进行组间t检验。P<0.05为差异有显著性意义。
结果
1 病理形态学观察
光镜下观察，对照组6小时显示损伤灶蛛网膜下腔出血，神经元变性坏死，胶质细胞呈空泡样变性，血管内有明显白细胞聚集和附壁现象，脑细胞水肿明显；24小时后坏死神经元增多，多发散在血管周围出血。治疗组脑细胞水肿明显减轻，变性坏死神经元减少，白细胞聚集减少，血管周围出血减少。
2 免疫组化结果
2.1 IL?1β表达情况 对照组：6小时即有大量阳性细胞，主要见于创伤侧皮质；24小时达峰值水平，与6小时比较，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组：6小时阳性细胞数较多，24小时后明显减弱，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)（图1）。
2.2 IL?1Ra表达情况 对照组：6小时后有极少数阳性表达；24小时阳性细胞数增多并维持至72小时，主要见于海马损伤区。治疗组：6小时即可见较强表达，并持续较高表达至72小时（图2）；与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。
2.3 IL?1β/IL?1Ra比值，治疗组同对照组各时相点比较有显著差异(P< 0.01)（见表1）。
3 Western blotting结果
IL?1β于创伤后6小时即有明显表达，24小时达高峰；后呈逐渐降低趋势，与对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。IL?1Ra在创伤后6小时基本检测不到，24小时和72小时有少量表达；治疗后6小时即有较高表达，并持续至72小时，与对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)（图3）。IL?1β/IL?1Ra比值，各时相点治疗组同对照组比较有显著差异(P<0.01)（见表2）。
图1 创伤后24小时。a.IL?1β表达于大量的棕黄染色的多极神经元和胶质细胞；b.治疗组阳性细胞明显减少(SABC ×400)（略）
图2 创伤后72小时。a.IL?1Ra主要表达于呈棕黄染色的神经元；b.治疗组阳性细胞明显增多(SABC ×400)（略）
图3 Western blotting检测损伤区脑组织IL?1β和IL?1Ra蛋白表达（略）
表1 损伤区脑组织IL?1β、IL?1Ra表达免疫组化ODI结果（略）
与伤后6小时相比：△P<0.05；与对照组相比：*P<0.05
表1 损伤区脑组织IL?1β、IL?1Ra表达的Western?Bloting结果（略）
与伤后6小时相比：△P<0.05；与对照组相比：*P<0.05
讨论
细胞因子及其受体有众多的生理功能，在严重创伤病理生理变化中起非常重要作用，而颅脑创伤后，脑组织内许多细胞因子表达会发生变化［4］。脑创伤后交感神经激活，儿茶酚胺分泌增多，通过β肾上腺能通道影响细胞免疫，诱发包括IL?1β在内的一系列炎性细胞因子释放，可能导致全身性免疫抑制［2，5］。
IL?1β、IL?1α和IL?1Ra同属于IL?1家族。研究提示，IL?1β与脑创伤关系密切,无论在临床患者或实验动物,都能发现脑创伤后脑组织、脑脊液中IL?1β表达水平的增高［1］。本实验结果印证了上述观点，大鼠脑创伤后6小时脑组织IL?1β表达即升高，24小时达高峰。迄今研究认为，在脑组织内，IL?1β主要来源于星型胶质细胞、小胶质细胞及神经元等［6］。IL?1β介入中枢神经系统的主要功能有：通过下丘脑?垂体?肾上腺(HPA) 轴,参与神经内分泌活动；调节垂体前叶细胞的生长；刺激胶质细胞的生长及分化；诱导其它细胞因子的产生,如神经生长因子(NGF)；抑制神经元钙离子的流通；增加γ?氨基丁酸(GABA)受体的活性等［5，7］。过量的IL?1β不仅促进神经兴奋毒性细胞坏死,而且通过激活蛋白激酶p38和c?Jun氨基末端激酶活性而诱发细胞凋亡［8］。我们推测，抑制IL?1β的过量表达或者阻断其与受体的结合，对脑创伤后有保护作用。
IL?1Ra 是体内唯一选择性阻断IL?1作用的受体拮抗剂,与IL?1β竞争性结合IL?1RI，阻止IL?1β介导的信号转导，是机体重要的内生性抗损伤物质。有研究将IL?1Ra分次注入脑创伤大鼠的侧脑室，发现可以明显减轻脑组织的损伤范围和程度。正常脑组织IL?1Ra mRNA表达较低，脑组织IL?1Ra含量很少，主要来自神经元和胶质细胞。本实验发现，脑创伤后可检测到少许IL?1Ra，并在检测时间内逐渐增多。比较本实验结果可以看出，创伤后IL?1Ra的表达升高明显滞后于IL?1β，这可能是IL?1β过量表达对机体造成损伤后自发的一种保护作用，但对IL?1β导致的早期损害，如神经元的变性坏死可能为时已晚。我们认为脑组织内IL?1β/IL?1Ra比值改变是脑创伤后颅内病理生理改变的一个重要因素。
普奈洛尔是一种非选择性β肾上腺素受体阻滞剂，其发挥药理作用的机制，主要是受体阻断作用和细胞膜效应。在临床患者和动物实验中发现很多高浓度的心血管药物会引起多种炎症介质的紊乱，普奈洛尔却没有这种现象［9］。实验中，我们对大鼠创伤前后给予普奈洛尔干预，光镜下观察脑组织病理形态改变，发现治疗组较对照组脑细胞水肿明显减轻，变性坏死神经元减少，神经胶质细胞增生减弱；创伤后各时相点脑组织IL?1β表达较对照组明显减少，IL?1Ra在伤后早期即有明显表达，并持续增多；IL?1β和IL?1Ra的表达变化和脑组织病理形态改变密切相关。我们认为，普奈洛尔能够影响大鼠脑创伤后IL?1β和IL?1Ra的表达，对脑创伤后早期有保护作用，其机制可能在于：（1）降低脑创伤后IL?1β的表达：抑制脑创伤后交感神经兴奋，减少儿茶酚胺的分泌，阻断β受体介导的CAMP?蛋白激酶A途径，降低创伤应激引起的IL?1β释放及由IL?1β诱发的其他致炎性细胞因子的表达，减弱了创伤后早期大量IL?1β对脑损伤的瀑布效应；（2）减少创伤后高分解代谢，降低能量需求［10］；（3）缓解脑创伤后中枢性高血压；（4）提高了脑创伤后脑组织中IL?1Ra的表达，对抗IL?1β的损伤作用，对于其影响IL?1Ra表达的机制尚不清楚，有待进一步研究。
【】
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