正交试验法优选黄柏酒炙的炮制工艺研究

                            作者：马雪松 邹兵 张凡 李峰 沈晓庆

    【摘要】  目的  优选酒炙黄柏的最佳炮制工艺。方法  以盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱的含量为评价指标，选择加酒量、炒温制度及炒制时间为考察因素，采用正交设计L9（34），优选黄柏酒制的最佳炮制工艺。结果  黄柏酒制的最佳炮制工艺为：每20g药材用黄酒（按每100kg黄柏药材使用20kg黄酒）闷润，在150～160℃下炒制6min。结论  酒炙黄柏的最佳炮制工艺合理可行。
    【关键词】  黄柏  酒炙  盐酸小檗碱  盐酸黄柏碱  正交实验 
 
    【Abstract】 Objective：To optimize the best preparation technology o Phellodendron Schneid. Method: The content of berberine and phellodendrine was regarded as evaluated index. The amount of adding wine, time for processing and temperature for processing were choosen as research factors. The process was selected with the orthogonal design L9（34） Result: The optimal procedure was set as follows：adding amount of 15ml wine per 100g Phellodendron Schneid. heating at 150～160℃ for 6 minutes. Conclusion: The optimal processing technology of Wine Fried Phellodendron Schneid. is reasonable．
    【Key words】 Phellodendron Schneid  Wine Fried  Berberine  Phellodendrine  Orthogonal experimental 
    黄柏为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid．的干燥树皮，药性苦、寒，入肾、膀胱经[1] 。有效成分为生物碱类化合物，另含柠檬苦素以及甾体等成分。在《本草纲目》中记载：“黄檗性寒而沉，生用则降实火，熟用则不伤胃，酒制则治上，盐制则治下，蜜制则治中”。其中酒制黄柏可以缓其苦寒之性，借酒力以上腾，能清上焦湿热，且能入血分，治血分之热。可用于治疗肝胆实热引起的头疼，耳鸣，咽喉肿痛，大便秘结等症[2]。据文献报道其生物碱成分中的盐酸小檗碱[3]和盐酸黄柏碱具有抗炎和抗癌活性，而黄柏碱同时具有降血压的疗效，其本身也是合成降血压药的母核[4]，故用小檗碱和黄柏碱作为考核黄柏酒制工艺的指标是可行的。因酒制法炮制黄柏其炮制工艺、具体工艺参数，文献中未见报道。因此本实验以盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱为指标，考察酒制黄柏的炮制工艺及最佳参数，为进一步研究酒制黄柏作用提供科学依据。
    1  仪器与试药
    1.1 仪器
    安捷伦1100-series液相色谱仪（G1314A紫外检测器）；METTLER AE240型十万分之一分析天平(瑞士METTLER)，KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，FA1004B电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，烘箱（WS70B-型）。
    1.2 药材
    黄柏药材，购自四川省药材公司，经辽宁中医药大学要用植物教研室王冰教授鉴定为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid．的干燥树皮。
    1.3 试剂与试药
    乙腈、甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。
    盐酸小檗碱对照品购自中国药品生物制品检定所（批号0713-9906）。
    盐酸黄柏碱对照品购自成都曼思特生物技术有限公司，供含量测定使用，纯度均大于98 %。
    黄酒（绍兴市古泉酿酒厂，批号20060926，酒精度9%）。
    2  方法与结果   
    2.1 盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱的含量测定
    2.1.1 盐酸小檗碱的含量测定
    对照品溶液的制备：精密称取盐酸小檗碱对照品9.52mg, 置100mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀,即得每1mL含盐酸小檗碱0.0952mg的对照品溶液。
    供试品溶液的制备：称取不同条件下炮制品粉末约0.1g，精密称定，制50mL容量瓶中，加甲醇约40mL，超声处理（功率250W，频率40kHz）40 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，既得。
    色谱条件：色谱柱TC-C18（150mm×4.6mm，安捷伦）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（体积比1：1）（每100mL加十二烷基硫酸钠0.1g），检测波长为265nm；流速：1mL/min；柱温为30℃。理论板数按盐酸小檗碱计算应不低于4000[1]。
    2.1.2 盐酸黄柏碱的含量测定
    对照品溶液的制备：精密称取盐酸小檗碱对照品0.415mg, 置100mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀,即得每1mL含盐酸小檗碱0.00415mg的对照品溶液。
    供试品溶液的制备：称取不同条件下炮制品粉末精密称定0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入1%醋酸甲醇25mL，超声处理（功率250W，频率40kHz）30 min，放凉，再称定重量，用1%醋酸甲醇补足减失的重量，摇匀，摇匀，取续滤液，即得。
    色谱条件：色谱柱TC-C18（150mm×4.6mm，安捷伦）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（40：60）（每100ml加十二烷基硫酸钠0.2g），检测波长为284nm；流速：1.0ml/min；柱温为30℃，进样量为5μl。理论板数按盐酸黄柏碱计算应不低于6000[1]。
    2.2 单因素实验考察
    2.2.1 加酒量的考察
    取黄柏饮片5份，每份20g，分别加入黄酒（每100kg药材分别用黄酒10kg、15kg、20kg、25kg）至密闭容器内，闷润4h后，在温度为150～160℃下炒制5分钟后出锅，放凉，备用。
    表2   加酒量考察结果

    结果表明，不同的加酒量下，盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱的含量有所不同，说明，加酒量是影响黄柏生物碱的主要因素。且从表2可以看出，在加酒量为每100kg药材用黄酒20kg是，生物碱的综合评分最高，因此每100kg药材用黄酒20kg进行下一组单因素考察。
    上式X为盐酸小檗碱含量， Y为盐酸黄柏碱含量，并对黄柏酒制品的综合评分的两个指标的参数各设为50%，下同。 
    2.2.2 闷润时间的考察
取黄柏5份，每份20g，加入黄酒（按每100kg药材用黄酒20kg）至密闭容器内，分别闷润1h、2h、4h、6h、8h后，在温度为150～160℃下，分别炒制5min后出锅，放凉，备用。
    表3  闷润时间考察结果

    结果表明不用闷润时间下，只要闷润时间超过1h以上，生物碱的含量变化不大，说明闷润时间不是影响黄柏中生物碱的主要因素。因此在正交试验中不选择闷润时间为考察因素。
    2.2.3 炒制温度的考察
    取黄柏5份，每份20g，加入黄酒（按每100kg药材用黄酒20kg）至密闭容器内，闷润4h后，分别在温度为120～130℃、130～140℃、140～150℃、150～160℃、160～170℃炒制5min后出锅，放凉，备用
    表4  炒制温度考察结果

    结果表明不同温度下，生物碱的含量有所不同，说明炒制的温度是影响生物碱含量的因素。从表4可以看出在温度为150～160℃下炒制的酒黄柏，生物碱的综合评分最高，因此选炒制温度为150～160℃进行下一组单因素考察。
    2.2.4 炒制时间的考察
    取黄柏5份，每份20g，加入黄酒（按每100kg药材用黄酒20kg）至密闭容器内，闷润4h后，在温度为150～160℃下分别炒制3min、4min、5min、6min、7min后出锅，放凉，备用。 
    表5  炒制时间考察结果

    结果表明在不同炒制时间下，生物碱的含量有所不用，说明炒制时间是影响生物碱含量的因素。从表5可以看出在炒制时间为5min时候的酒黄柏，生物碱的综合评分最高。
    2.3 正交试验
    由上述单因素考察可以看出酒炙黄柏虚考虑的主要因素有加酒量、炒制温度、炒制时间3个因素，故以加酒量、炒制温度、炒制时间为考察因素，以盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱的含量为指标，根据单因素考察设计正交试验因素水平表，按L9（34）正交试验表进行实验，其因素水平表见表6，正交试验设计见表7，方差分析表见表8
    表6 因素水平表

    表7 正交试验设计表