重组人生长激素对大鼠脑缺血/再灌注损伤后缺血侧大脑皮质Survivin和 Caspase3表达的影响
作者：郭耀强 白宏英 曾志磊 刘海涛 方李鸿
【摘要】 目的 观察重组人生长激素(recombinant human growth hormone，rhGH)对大鼠脑缺血/再灌注损伤后缺血侧大脑皮质存活素(Survivin)和半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶3 (Caspase3)表达的影响。方法 采用大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤模型,将72只健康雄性SD大鼠,随机分为假手术组、对照组和治疗组。分别于模型制作成功后1、3、5、7 d处死大鼠,采用连续切片免疫组织化学技术分别检测缺血侧大脑皮质Survivin 和Caspase3的表达。结果 治疗组Survivin表达较对照组明显增多,而Caspase3表达较对照组显著减少。结论 脑缺血/再灌注损伤早期应用rhGH可上调Survivin表达及下调Caspase3表达,抑制神经元的凋亡。
【关键词】 脑缺血/再灌注损伤;重组人生长激素;Survivin;Caspase3;细胞凋亡
【Abstract】 Objective To observe the effects of recombinant human growth hormone(rhGH) on the expressions of Survivin and Caspase3 in rats with cerebral ischemiareperfusion injury. Methods The model of focal cerebral ischemiareperfusion injury was made by occluding middle cerebral artery(MCA)for 2 hours and reperfusion.Seventytwo healthy male SD rats were randomly divided into the shamoperated group, control group and treatment group. And immunohistochemistry technique was used to detect the condition of the expression of Survivin and Caspase3 in three groups respectively.Results The expression of Survivin was markly increased and Caspase3 was obviously decreased in treatment group compared with control group. Conclusion It is demonstrated that treatment with recombinant human growth hormone could induce expression of Survivin and suppress the activity of Caspase3 in neurons within the cerebral cortex. It can inhibit the neuronal apoptosis.
【Key words】 Cerebral ischemiareperfusion injury; Recombinant human growth hormone;Survivin;Caspase3;Apoptosis
重组人生长激素(recombinant human growth hormone，rhGH)在1986年通过基因工程技术合成，与人生长激素(human growth hormone, hGH)结构相同，目前主要用于治疗生长激素缺乏性侏儒症、烧伤、抗炎及不育症等。近年来,国内外研究表明,生长激素具有减轻大脑缺血缺氧引起的损伤,抑制细胞凋亡,促进细胞存活等作用[14],但机制还不十分清楚。目前,尚未有生长激素对脑缺血/再灌注损伤后Survivin、Caspase3表达影响的报道。本实验通过应用rhGH观察大鼠脑缺血/再灌注损伤后缺血侧大脑皮质Survivin、Caspase3表达的变化,探讨其神经保护作用的可能机制,为临床治疗探索新的方法及思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组 健康雄性SD大鼠72只,体质量250～280 g,由郑州大学实验动物中心提供。术前禁食12 h,禁水4 h。随机分为假手术组、对照组(脑缺血/再灌注+生理盐水组)、治疗组(脑缺血/再灌注+rhGH组)3组,每组24只。
1.2 主要试剂和药物 重组人生长激素注射液由长春金赛药业有限责任公司生产; Survivin多克隆抗体及Caspase3多克隆抗体购自美国SANTA CRUZ生物技术公司。
1.3 大鼠脑缺血/再灌注模型的制备及处理 线栓法大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型采用改良的Longa[5]线栓法,大脑中动脉(MCA)阻断2 h后,将尼龙栓线拔出,实现再灌注。假手术组除不插线外,其余步骤与对照组和治疗组相同。参照 Zea Longa 5级4分制评分标准[5]，评分为1～3分的实验动物入选。治疗组在脑缺血/再灌注模型成功后开始颈部皮下注射重组人生长激素0.1 U·kg1· d1,1次/24 h。对照组注射同样剂量生理盐水,注射时间与次数同治疗组。
1.4 组织切片和免疫组化检测 分别于脑缺血/再灌注后1、3、5、7 d处死大鼠,以4%多聚甲醛灌注固定,石蜡包埋和切片。常规脱蜡、水化,取缺血侧大脑皮质,按试剂盒提供的实验步骤进行操作,DAB显色,光镜下观察,胞浆出现棕色颗粒为阳性着色。
1.5 免疫组化结果分析 在光镜下观察Survivin 和Caspase3免疫反应的结果,并采用Biosens Digital Imaging System v1.6(上海山富科学仪器有限公司) 图像分析系统进行图像定量分析。Survivin 和Caspase3免疫组化染色标记强度用灰度值表示,比较各组阳性区平均灰度值的差异。
1.6 统计学处理 所有数据采用SPSS 13.0软件处理,各组数据以±s表示,组间比较采用单因素方差分析,用LSDt法进行两两比较,检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 大脑皮质Survivin表达的变化 假手术组大鼠脑组织中Survivin仅有少量表达,对照组1～3 d达到高峰,随后逐渐降低,至7 d仍有较高水平的表达,较假手术组显著升高;治疗组较对照组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
2.2 大脑皮质Caspase3表达的变化 Caspase3在假手术组少量表达,对照组1～3 d达到高峰,后开始下降,至7 d时仍高于假手术组;治疗组较对照组显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。表1 各组Survivin表达的变化(阳性区平均灰度表示)注：与假手术组同一时间点比较,△P<0.05;与对照组同一时间点比较, ▲P<0.05 表2 各组Caspase3表达的变化(阳性区平均灰度表示)注：与假手术组同一时间点比较,△P<0.05;与对照组同一时间点比较,▲P<0.05