助孕胶囊对多囊卵巢大鼠卵巢组织白血病抑制因子表达的影响
作者：刘艳巧 党慧敏 刘润侠 康晓玲
【摘要】 ：目的 观察助孕胶囊对多囊卵巢(PCO)大鼠生殖内分泌激素、卵巢白血病抑制因子(LIF)表达的影响,分析其可能的作用机制。方法 采用孕激素联合人绒毛膜促性腺激素(HCG)造模法制备PCO模型大鼠。随机分为对照组、PCO模型组、PCO模型组＋助孕胶囊组(中药组)、PCO模型组＋克罗米酚组(西药组),采用放免法测定血性激素水平的变化,光镜观察卵巢、卵泡发育的情况,免疫组化法检测卵巢组织LIF的表达水平。结果 助孕胶囊可使PCO大鼠的颗粒细胞层增厚,卵泡膜细胞层变薄,血清雄激素(T)、黄体生成素(LH)水平均明显下降,E2、FSH水平上升,并上调卵巢组织LIF的表达(P<0.05)。结论 助孕胶囊能够降低PCO大鼠血清中T、LH水平,升高E2、FSH水平,上调卵巢组织LIF的表达,从而促进卵泡的发育、成熟及排卵。
【关键词】 多囊卵巢综合征 助孕胶囊 大鼠 白血病抑制因子
Abstract：Objective To observe the effect of Zhuyun Jiaonang (ZYJN) on procreate endocrine hormone and the expression of leukemia inhibitory factor (LIF) on ovaries in rat of PCO, and analyze the possible therapeutic mechanism. Methods The PCO rat models were set by pregnancy hormone combine with human chorionic gonadotrophin (HCG), randomly divided into four group, including control group, model group, Chinese crude drug group (CCDG) and western medicine group (WMG). The levels of serum gonadal hormone were detected by radioimmunoassay. The effects of ZYJN on ovaries and ovarial follicular development were observed by light microscope. The expressed level of LIF was detected by using the immunohistochemical staining technique. Results ZYJN could increase the thickness of granular cell layer ovary and decrease the thickness of theca cell layer. ZYJN greatly decreased the level of T and LH, increased the Level of E2 and FSH in serum, and increased the expression of LIF in ovary (P<0.05). Conclusion ZYJN has effect of decreasing the level of T and LH and increasing the expression of LIF in ovary, adjusting genitical gland and promoting the mature and ovulation of follicular.
Key words：polycystic ovarian syndrome；Zhuyun Jiaonang；rat；leukemia inhibitory factor
多囊卵巢综合征(PCOS)是一组发病多因性、临床表现多态性的综合征,以雄激素过多和持续性无排卵为临床特征。助孕胶囊为临床经验方,对PCOS导致的月经不调、不孕不育有良好的疗效。白血病抑制因子(LIF)在PCOS的发生、发展中起重要作用。本实验通过建立多囊卵巢(PCO)大鼠模型,研究助孕胶囊对PCO大鼠卵泡发育、性激素水平及 LIF表达的影响,以期阐明助孕胶囊对PCOS的治疗作用及可能的分子生物学作用机制, 为中药调经助孕提供科学依据。
1 实验材料
1.1 动物
健康SD雌性大鼠,24日龄,体重50 g左右,西安交通大学医学院动物实验中心提供。
1.2 药物
中药助孕胶囊(主要为紫河车、红花、胆南星等成分),由西安交通大学医学院第二附属医院中药制剂室提供,0.4 g/粒,1 g胶囊含原药材1.575 g；克罗米酚(CC),上海衡山药业有限公司生产,批号040301,50 mg/粒。
2 实验方法
2.1 造模
参照文献[1]的方法,选用24日龄未成年雌性SD大鼠, 皮下埋植左旋18-甲基炔诺酮硅胶棒(3 mm),在27日龄时每日2次皮下注射1.5 IU人绒毛膜促性腺激素(HCG)；正常对照组每日2次皮下注射注射用水,共注射9 d。37日龄连续阴道涂片2个性周期。采血,测雄激素(T)、胰岛素(INS)水平。观察到阴道角化细胞持续出现及结合血清T、INS测定,符合标准者作为PCOS大鼠模型,不符合者剔除。对照组连续阴道涂片2个性周期,全部呈现完整的动情周期,血清T、INS测定在正常范围。
2.2 分组
将大鼠分为4组,正常对照组10只。PCO模型大鼠自47日龄起,称体重,分组观察。将30只模型大鼠随机分为模型组、助孕胶囊组(中药组)、CC组(西药组),每组10只。
2.3 给药
中药组按助孕胶囊原药材6 g/(kg·d)给药,西药组按人与大鼠公斤体重折算系数给药,CC 20 mg/(kg·d)。对照组和模型组大鼠同期灌服同体积蒸馏水1 mL/100 g体重,1次/d,共14 d。
2.4 观察内容
2.4.1 血清学测定
末次给药后24 h,2%戊巴比妥钠0.3 mL腹腔麻醉,打开腹腔,腹主动脉取血,离心,分离血清,采用放射免疫法检测血清性激素(FSH、LH、E2、T)水平,西安交通大学第二医院放免检验科按操作程序测定,批内批间误差<10%。性激素放射免疫分析药盒购自拉尔文生物工程技术有限公司。
2.4.2 病理观察
双侧卵巢大体解剖观察,并取下双侧卵巢组织,用10%的甲醛液固定,常规石蜡包埋、切片,待做HE染色及免疫组织化学分析,光镜观察卵巢的组织形态改变及卵泡的大小发育情况。
2.4.3 白血病抑制因子表达的SP免疫组化染色
应用免疫组化SP法检测卵巢组织LIF表达。SP试剂盒和LIF单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发公司,应用DAB显色,均进行抗原修复、HE染色,切片厚4 mm,并行阴性和阳性对照。免疫组化结果判定：阳性染色为棕黄色颗粒,特异性位于细胞膜周围。对综合染色强度和分布范围进行半定量评分。评分标准：阴性为0分；染色弱但明显强于阴性对照者为1分；染色清晰者为2分；染色强者为3分。阳性细胞数<5%者为0分；5%～10%为1分；10%～30%为2分；>30%为3分。上述两种评分相加为表达强度评分。
2.5 统计学方法
所有数据均以—x±s表示,各测量值间的比较用ANOVA方差分析,P<0.05为具有显著性差异。
3 结果
3.1 光镜结果
对照组镜下见多个黄体及不同发育阶段的卵泡,初级卵泡位于浅层,数目较多,体积小,呈圆形或椭圆形；生长卵泡大小不一,位置较深,成熟卵泡多位于浅表部,可见卵泡腔、卵细胞及卵丘结构；颗粒细胞呈多层(多为6～8层),形态完整,排列整齐,卵泡膜细胞呈梭形排列。模型组镜下见卵泡颗粒细胞减少而膜细胞层增加,后者常发生黄素化,卵巢皮质间质细胞明显增生,其中可见散在丛状的黄素化细胞巢。西药组在镜下仍可见黄素化的膜细胞层增加,卵巢皮质间质细胞增生,同时可见皮质内出现许多初级卵泡、生长卵泡及少量成熟卵泡,颗粒细胞层数增加,泡膜细胞层变薄,黄体组织数量较模型组明显增多。中药组镜下可见皮质内大多数卵泡为正常发育的卵泡,有初级卵泡、生长卵泡及成熟卵泡；颗粒细胞层数明显增加,约为4～5层,形态完整,排列整齐；泡膜细胞层明显变薄,黄体组织数量较模型组明显增多。
3.2 性激素及白血病抑制因子表达变化
(见表1)表1 各组大鼠生殖内分泌激素及LIF蛋白表达测定结果(略)注：与对照组比较,*P<0.05；与模型组比较,▲P<0.05；与西药组比较,#P<0.05
4 讨论
PCOS患者生殖功能障碍的主要特征是卵泡发育障碍和无排卵,高雄激素血症是PCOS的基本病理生理改变之一。本研究中PCO模型大鼠血T水平显著高于对照组,而中药组大鼠血清T水平明显低于模型组,西药组大鼠血清T水平与模型组之间相比则无显著性差异,说明助孕胶囊与CC相比,能显著降低血清T水平,可以有效调节PCO大鼠T的代谢紊乱。已有研究证明,方中的白芍能有效降低血中T浓度,改善排卵状态,其作用机制在于直接抑制卵巢和肾上腺分泌T,而且不影响垂体分泌LH和FSH[2]；而CC为人工合成的非甾体制剂,它具有较强的抗雌激素作用和较弱的雌激素活性。本研究结果表明,相比助孕胶囊,其不能明显降低血清T水平,故无抗雄性化的作用。
已知PCOS另一个重要的病理特征是垂体促性腺激素分泌的不协调,即LH明显高于FSH,LH/FSH>2～3,并缺乏排卵前LH峰。本实验结果表明,PCO模型大鼠血清LH水平显著高于对照组,而中药组水平明显降低,说明助孕胶囊能明显降低PCO大鼠的LH水平,从而促使建立正常的反馈作用,恢复性腺的正常调节。其作用途径可能为：方中的补肾中药能在多个环节调节性腺轴的功能,其中包括调节下丘脑GnRH的分泌,垂体LH、FSH的释放、卵巢性激素的合成和分泌,并可调节垂体对 LH-RH的敏感性、卵巢对LH的反应性及卵巢受体的形成[3]。
LIF是一种具有广泛生物学功能的细胞因子。近来大量研究表明,LIF可影响生殖活动的多个环节,包括卵泡的生长发育及胚胎的生长、发育、分化、着床等。卵巢颗粒细胞、卵泡膜细胞和间质细胞可产生LIF,通过自分泌和旁分泌参与卵巢功能的调节,促进卵泡生长、发育和成熟。同时有研究表明,雌激素主要是E2能刺激LIF的产生,两者呈剂量依赖关系,而孕激素和皮质类固醇激素并无刺激LIF产生的作用[4],随着雌激素剂量的增加,LIF的量也随着增加。Ledee-Bataille等[5]检测卵泡液中的LIF水平,发现LIF在未妊娠的PCOS患者的卵泡液中的浓度较对照组明显下降。本实验研究表明,在卵巢颗粒细胞、基质细胞及卵泡液中均有LIF的表达,且PCO大鼠卵巢LIF表达水平明显低于正常对照组,进一步证实了LIF可能通过某种方式促进卵细胞发育、成熟和排卵。从本实验结果分析,助孕胶囊与CC相比,显著升高血清E2水平的同时亦能够显著增强PCO大鼠卵巢颗粒细胞LIF的表达,推测其可能通过升高E2水平从而刺激卵巢产生LIF,进而促进卵母细胞的发育,调节排卵。
PCOS属中医学“不孕”、“闭经”、“崩漏”、“癥瘕”范畴。认为其病机多与肝、肾、脾三脏功能失调及痰、湿、气、血的瘀滞密切相关。本实验结果提示,助孕胶囊可以使PCO大鼠的卵巢颗粒细胞层增厚,卵泡膜细胞层变薄,降低血清T、LH水平及上调卵巢组织中LIF表达水平,通过多种机制改善PCOS卵泡的发育,促使优势卵泡的产生,进而诱导排卵。说明助孕胶囊具有多种调控效应,在调整H-P-O轴的同时,对卵巢局部细胞因子亦具有调节作用。表明助孕胶囊发挥整体调节作用是通过多位点微观调控来实现的,这种微观效应的弥散性、多样性与整体调节的统一性、平衡性是助孕胶囊治疗PCOS的优势所在。
【参考文献】
[1] 朱 辉,倪 江,姚兰春,等.大鼠多囊卵巢动物模型的实验研究[J].哈尔滨医科大学学报,1999,33(3)：187－188.
[2] 归绥琪,俞 瑾,魏美娟,等.补肾中药对雄激素致不孕大鼠垂体、卵巢及肾上腺作用的实验研究[J].中国中西医结合杂志,1997,17(12)：735.
[3] 杨宗孟.女宝治疗女子肾虚不孕46例临床观察初步小结[J].长春中医学院学报,1988,4(10)：10.
[4] Sawai K, Matsuzki N, Okada T, et al. Human decidual cell biosynthesis of leukaemia inhibitory factor：regulation bydecidual cytokines and steroid hormones[J]. Biol Reprod,1997,56(5)：1274－1280.
[5] Ledee-Bataille N, Lapree-Delage G, Taupin JL, et al. Follicular fluid concentration of leukemia inhibitory factor is decreased among woman with polycystic ovarian syndrome during assisted reproduction cycles[J]. Hum Reprod,2001,16(10)：2073－2078.