不同部位及生长年限云南红豆杉中紫杉醇含量的测定
【摘要】 ：目的 研究云南红豆杉不同部位中紫杉醇的含量以及不同生长年限对云南红豆杉枝叶中紫杉醇含量的影响。方法 采用HPLC法,Hypersil ODS2色谱柱,流动相为甲醇-乙腈-水(20∶30∶50),柱温30 ℃,检测波长227 nm,比较云南红豆杉的树皮、针叶、小枝和树根中紫杉醇的含量,以及不同生长年限对云南红豆杉枝叶中紫杉醇含量的影响。结果 云南红豆杉树皮中紫杉醇的含量最高,根中最少,小枝、针叶中含量较高；随着生长年限的增加,云南红豆杉枝叶中紫杉醇的含量逐渐增加。结论 云南红豆杉枝叶的采摘以5年生以上为佳。
【关键词】 云南红豆杉 紫杉醇 高效液相色谱法
Abstract：Objective To study the content of taxol in different parts of Taxus Yunnanensis and the effects of different growth time on taxol content. Method A HPLC method was developed for the detetmination of taxol content in bark, needle, twig, root from Taxus Yunnanensi, and the effects of different growth time. Results Taxol content in bark was the highest, that in root was the lowest and that in needle and twig were higher. Taxol content was higher with the growth time in needle and twig of Taxus Yunnanensi. Conclution It was significant to take taxol from needle and twig of Taxus Yunnanensis which is more than five years growth time.
Key words：Taxus Yunnanensis；taxol；HPLC
紫杉醇是从红豆杉树皮中分离的一种二萜类化合物,能有效地治疗晚期乳腺癌、卵巢癌等,被认为是癌症治疗的重大进展之一。目前,市售紫杉醇主要从天然和栽培红豆杉中直接提取而得。紫杉醇资源极其有限,在树皮中的含量也仅为0.01～0.07%[1]。为充分利用资源,保护稀少树种,近几年来从其它部位提取紫杉醇正在受到关注。紫杉醇在植物体内含量还受多种因素的影响[2],有报道东北红豆杉枝叶生长年限越长含量越高,也有报道短叶红豆杉枝子越嫩含量越高。我们采用HPLC法考察了云南红豆杉(Taxus yunnanensis)不同部位中紫杉醇的含量,以及不同生长年限对云南红豆杉枝叶中紫杉醇含量的影响。
1 材料
1.1 仪器
Angilent HP1100高效液相色谱仪；G1314A紫外检测器；KQ-500DE型超声仪；LG10-2.4A型医用离心机；固相萃取小柱(Accubond Ⅱ SPE ODS-C18 Cartridges, Agilent,12 mL)；固相萃取装置(美国JTBaker公司)。
1.2 药物
药材均采自云南大理云龙县,经南方医科大学生药室鉴定为云南红豆杉(Taxus yunnanensis Cheng et L.K.Fu)的树皮、根、枝叶。
1.3 试剂
紫杉醇(批号100382-200203),中国药品生物制品检定所提供；甲醇、乙腈为色谱纯,水为高纯水；其余试剂均为分析纯。
2 方法及结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Hypersil ODS(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流动相：甲醇-乙腈-水(20∶30∶50)；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：227 nm；进样量：10 μL。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取紫杉醇对照品适量,加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液,作为对照品贮备液。
2.3 线性关系考察
精密量取以上对照品储备液,加甲醇配成浓度为0.004、0.01、0.03、0.05、0.08、0.12、0.3 mg/mL的对照品溶液。吸取上述对照品溶液各10 μL,分别注入液相色谱仪,按上述色谱条件进行分离,测得峰面积。将峰面积对进样量进行回归,得紫杉醇的回归曲线为：Y＝2 252.517X＋52.423(r＝0.999 8),表明在0.04～3.0 μg之间呈线性关系。
2.4 供试品溶液的制备
供试样品自然干燥,粉碎成细粉,过60目筛,40 ℃减压干燥。称取药材细粉约2～4 g,精密称定,置具塞三角瓶中,加入乙酸乙酯-丙酮(1∶1)30 mL,25 ℃超声提取40 min,滤过,残渣再同法超声提取1次。合并上清液,减压蒸干,残渣加入石油醚(20 mL×3次),超声洗涤3次,离心分离。弃去石油醚液,残渣挥干石油醚,加入氯仿(20 mL×4次),超声振荡,离心分离。上清液合并,减压浓缩至干,作为待用样品。取固相萃取小柱,依次加入甲醇12 mL,抽干,0.01 mol/L的乙酸铵缓冲溶液12 mL,抽干。将样品溶于少量80%的乙酸铵甲醇溶液中,上柱,抽干,依次用0.01 mol/L的乙酸铵12 mL、50%的乙酸铵甲醇溶液12 mL淋洗,抽干,再加入80%的乙酸铵甲醇溶液12 mL洗脱,收集洗脱液,减压蒸发,残渣用甲醇溶解,定容至1 mL,甲醇液经0.45 μm微孔滤膜滤过,作为供试品溶液。对照品和供试品图谱见图1。