周氏克金岩方抗A549肺癌细胞多糖组分的研究
作者：阳美平,尹莲,张旭,吴皓,孙怡,段金廒
【摘要】 目的 研究周氏克金岩方治疗肺癌的物质基础。方法 用醇沉法提取周氏克金岩方多糖,采用Sevag法纯化,DEAE纤维素阴离子交换树脂制备多糖组分,紫外光谱检测蛋白存留情况,红外光谱分析组方药的归属,采用蒽酮-硫酸比色法测定多糖组分含量。结果 该有效多糖组分在240 nm和260 nm处无吸收,其红外光谱图与组方药玉竹、猫爪草和仙鹤草的红外光谱图有很大的相似性,周氏克金岩方中该多糖组分含量为1.41%。结论 抗A549肺癌细胞多糖组分不含蛋白和核酸,来源于组方药玉竹、猫爪草和仙鹤草,周氏克金岩方中含有一定量的多糖组分。
【关键词】 周氏克金岩方；多糖；抗肺癌A549细胞活性
Abstract：Objective To study content and ascription of the composition of the polysaccharides from Zhou’s Prescription for Resolving Mass. Method The polysaccharide was extracted by ethanol precipitation, and purified by savage method. DEAE-cellulose anion exchange resin was used to prepare the composition of polysaccharides. UV-spectra was used to detect protein and IR-spectra was used to analyses the ascription of the composition of polysaccharides. The content of the composition of polysaccharides was determined by anthranone-sulfuric acid method. Result There was no absorption at 240 nm and 260 nm. The IR spectrum graph of the polysaccharides was similar to Polygonatum odoratum, Radix Ranunculi Ternati and Agrimonia pilosa Ledeb. The content of the composition of polysaccharides was 1.41%. Conclusion The composition of polysaccharides does not contain proteins and nucleic acids, and come from Polygonatum odoratum, Radix Ranunculi Ternati and grimonia pilosa Ledeb.
Key words：Zhou’s Prescription；polysaccharides；anti-lung cancer of A549
周仲瑛抗肺癌有效经验方又名周氏克金岩方,由沙参、麦冬、猫爪草、仙鹤草、红花、玉竹等药组成。其在改善肺癌患者临床症状、稳定瘤体、防止复发、提高生活质量等方面均有良好的作用。前期研究已筛选出周氏克金岩方抗肺癌A549细胞多糖有效组分,本试验旨在对该多糖组分进行组方药归属分析和含量测定,为深入研究该方抗肺癌物质基础提供依据。
1 仪器与试药
UV-2401紫外分光光度计；FA1104N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；IR-435红外光谱仪(日本岛津)。蒽酮(分析纯、国药集团化学试剂有限公司),浓硫酸(上海化学试剂有限公司)；DEAE(OH-1)纤维素(上海恒信化学试剂有限公司)；乙醇、正丁醇、三氯甲烷等试剂为分析纯。葡萄糖(中国药品生物制品检定所)；麦冬、沙参、猫爪草、仙鹤草、红花、玉竹等均购自于安徽铜陵中药饮片有限公司。
2 方法与结果
2.1 样品的制备
2.1.1 复方多糖成分的提取
全方药材粗粉用水浸泡1 h,然后煮沸1 h,过滤,收集滤液,共提取3次。合并滤液、浓缩,将浓缩后的滤液加乙醇至含醇量达70%,离心,弃去上清液,沉淀用蒸馏水溶解,采用Sevag法除去蛋白,用氯仿-正丁醇(5∶1)萃取多糖水溶液,静置后弃去中间变性蛋白层,反复多次,直到蛋白除尽为止。将上层水液浓缩至干燥,即为复方多糖提取物。
2.1.2 多糖组分的精制
取部分“2.1.1”项下的多糖提取物溶于蒸馏水,上DEAE纤维素柱(OH-型),收集0.15 mol/L NaCl洗脱液,透析脱盐,浓缩干燥,即得精制多糖组分。
2.1.3 单味药材多糖成分的制备
分别取麦冬、沙参、玉竹、猫爪草、仙鹤草等按“2.1.1”项下的操作方法制得单味药材多糖提取物。
2.1.4 葡萄糖标准品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的葡萄糖0.038 5 g,用蒸馏水定容到25 mL,得1.54 mg/mL葡萄糖标准液。
2.1.5 多糖组分贮备液的制备
取“2.1.2”项下制得的精制多糖组分3 mg,精密称定,用蒸馏水定容至25 mL,作为多糖组分贮备液。
2.1.6 复方多糖供试液的制备
取“2.1.1”项下制得的复方多糖提取物0.101 36 g,精密称定,置25 mL容量瓶中,稀释至刻度,作为复方多糖供试液。
2.2 多糖组分的定性分析
2.2.1 紫外扫描分析
取多糖组分适量,加0.9%NaCl溶液溶解,配成浓度为5 mg/mL的溶液,在200～400 nm范围内扫描,结果表明,在240 nm和260 nm处无吸收,表明该多糖不含核酸和蛋白质。