贯叶金丝桃总黄酮提取工艺研究
2.2.4 稳定性试验
取样品溶液,分别在0、1、2、3、4 h取样1.0 mL,计算样品中贯叶金丝桃总黄酮含量,结果样品在4 h内稳定,RSD＝1.88%。
2.2.5 重复性试验
取贯叶金丝桃粉末2.0 g(共6份),按供试品制备方法及测定方法分别制备和测定,计算贯叶金丝桃总黄酮含量,结果RSD＝1.96%。
2.2.6 加样回收率试验
精密称取已知贯叶金丝桃总黄酮含量的贯叶金丝桃粉末0.05 g(共6份),精密加入芦丁对照品适量,依法制备样品和测定,计算含量,结果见表2。表2 总黄酮加样回收率试验结果（略）
2.2.7 样品含量测定
将供试品溶液比色,测定贯叶金丝桃提取物中总黄酮的含量,计算总黄酮的提取率。
3 正交试验
3.1 正交设计
取100 g贯叶金丝桃(其中金丝桃苷含量为7.12 mg/g,总黄酮为48.58 mg/g)碎成粗粉,用乙醇加热回流提取,过滤,滤液减压回收乙醇至无醇味,加沸水1 000 mL溶解,冷却,过滤,浓缩,干燥,得到贯叶金丝桃提取物,并进行含量测定。以总黄酮的提取率和金丝桃苷的提取率为指标,采用正交设计对贯叶金丝桃总黄酮的提取工艺条件进行优选。根据文献和预试验结果,选择醇浓度(A)、溶媒用量(B)、提取时间(C)、提取次数(D)4个试验因素,每个因素3个水平,按L9(34)正交表进行试验,因素水平安排见表3。表3 贯叶金丝桃提取工艺因素水平表（略）
3.2 结果分析
根据贯叶金丝桃提取工艺相关文献[1-4],以贯叶金丝桃总黄酮、金丝桃苷的提取率为指标,权重系数均为0.5,试验结果和方差分析见表4、表5。表4 正交试验结果（略）表5 方差分析表（略）注：F0.05(2,18)=3.55,F0.01(2,18)=6.01
结果表明,贯叶金丝桃采用乙醇回流提取,以总黄酮提取率、金丝桃苷提取率为检测指标时,提取溶媒、溶媒用量有显著影响,提取次数、提取时间没有显著影响。各因素对测定结果的影响次序为A＞B＞C＞D,优选工艺为A2B2C3D2,即用8倍量70%乙醇,提取3次,每次2 h。
3.3 验证试验
为进一步考察上述优选工艺的稳定性,按各种最佳条件,进行重复提取3次,每次100 g。100 g药材提取物,同上述处理方法、检测方法分析总黄酮和金丝桃苷,计算100 g药材中二者的提取量,结果见表6。证明优选的工艺条件为最佳工艺条件。表6 提取工艺验证试验结果（略）
4 讨论
贯叶金丝桃为常用药材,其中总黄酮部分有明显的生物活性,其中金丝桃苷是其主要活性成分。因此,以贯叶金丝桃总黄酮及金丝桃苷为检测指标评价贯叶金丝桃提取工艺较为客观合理。总黄酮的分析方法较多[5-8],如紫外分光光度法、NaNO2比色法、HPLC法等。由于贯叶金丝桃中含有多种黄酮类化合物,采用HPLC需要多个对照品,含量测定比较繁琐；紫外分光光度法杂质干扰很大,所以,采用NaNO2比色法测定总黄酮的含量。采用HPLC法测定金丝桃苷含量,质控方法简便可行,重复性和精密度均好,因此,该法可以作为贯叶金丝桃提取物中金丝桃苷含量的测定方法。
正交试验法优选提取工艺结果表明,提取溶媒、溶媒用量、提取次数对总黄酮提取率有极显著影响,提取时间影响不大,理论的最佳提取工艺为70%乙醇,8倍量,提取3次,每次2 h。为考察最佳工艺的合理性,并进行了验证试验,结果表明优选的工艺条件合理、可行。
提取液浓缩至无醇味后,若用水处理,笔者发现金丝桃苷和总黄酮损失很大,所以,在这一步操作过程中笔者采用沸水处理,总黄酮和金丝桃的损失较少。
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