荭草不同药用部位抗心肌缺血作用及化学成分比较研究

                作者：黄勇，郑林，王爱民，兰燕宇，李勇军，何迅，王永林

【摘要】  目的针对荭草对心血管方面的作用，确定荭草药材的药用部位。方法以大鼠和家兔为实验动物，采用结扎冠脉造成急性心肌缺血和离体心脏冠脉流量灌注模型，分别观察荭草各部位(全株、根及粗茎、带叶茎枝、花穗)对上述实验模型心电图、心肌梗塞范围和冠脉流量的影响;同时对不同药用部位化学成分(异荭草素、荭草素和原儿茶酸)及其指纹图谱进行测定，以探讨荭草对心血管作用的物质基础。　　结果荭草全株、带叶茎枝、花穗均能不同程度改善缺血心肌心电图，使缺血范围降低;可明显增加离体心脏的冠脉流量。其中带叶茎枝和花穗的综合作用较优，而根及粗茎最弱。不同部位异荭草素、荭草素和原儿茶酸的含量均呈现相同趋势：带叶茎枝>花穗>根及粗茎;指纹图谱亦显示不同药用部位的特异性差异。结论荭草的带叶茎枝和花穗可能是心血管疾病治疗的有效药用部位，并且其中异荭草素、荭草素等化学成分的多寡与药效强度具有一定相关性，可为药材的临床应用和质量控制提供依据。

【关键词】  荭草;药用部位;心肌缺血;化学成分

　Abstract：ObjectiveTo find out the effect of medicinal parts of Polygonum orientale on cardiovascular disease.MethodsThe models of acute myocardial ischemia induced by ligating coronary artery in rats and coronary artery flow(CF) in isolated heart of rabbits were applied. The effects of different medicinal parts(including the whole plant,root & main stem,branch with leaves, ear) on the ECG, the infarct sizes and CF of heart were observed.The contents of chemical constituents(isorientin, orientin,protocatechuic acid) and HPLC fingerprint were determined in order to find out the substance basis in cardiovascular disease respects.ResultsThe extracts from whole plant,root & main stem,branch with leaves and ear of the plant could improve the change of ECG, decrease the range of myocardial ischemia and increase the CF to varying degrees. The samples of branch with leaves and ear showed more comprehensive effect, while the ones of root and main stem did poor. Contents of isorientin, orientin and protocatechuic acid of different medicinal parts showed the same tendency: branch with leaves>ear>whole plant>root & main stem.The HPLC fingerprint also reflected distinctive characteristic of the different parts.ConclusionThe branch with leaves and ear of Polygonum orientale may be the effective medicinal parts on cardiovascular disease, and the intensity of pharmacodynamics is closely related to the contents of isorientin, orientin and protocatechuic acid, so these chemical constituents can provide scientific basis for clinical application and quality control of Polygonum orientale.

　　Key words：Polygonum orientale; Medicinal parts;Myocardial ischemia;Chemical constituents

　　荭草为蓼科植物荭蓼Polygonum orientale L. 的干燥全草，生于路旁和水边湿地，分布较广，具有祛风利湿，活血消肿的功效，用于治疗风湿性关节炎、冠心病、疝气等[1]。据《中华本草》《中药大辞典》等记载[2，3]荭草的茎叶、果实、根和花均可作为不同部位入药，而且功能主治有所差异。而据现代药理学研究表明，以单味荭草制备的注射液有广泛的心血管系统药理活性，如增加心肌营养血流量及冠脉流量，改善急性心肌缺血缺氧状态，同时能减少心肌耗氧和提高机体在低氧状态下的氧利用能力;减弱离体心脏的收缩力和心率，能使外周血管扩张，血压轻度下降等[4，5]。贵州荭草资源丰富，民间将其用于治疗胸痹心痛，心胃气痛，但用药部位较为混乱。因此，为了更好地利用荭草的药用价值，有效开发药材资源，本研究采用实验性大鼠心肌缺血、兔离体心脏冠脉流量灌注实验对比考察了荭草不同药用部位的药效强度;化学成分研究的结果表明荭草主要含黄酮类和酚酸类成分[6]，根据文献[7~10]本研究对荭草不同部位中黄酮类成分异荭草素和荭草素、酚酸类成分原儿茶酸测定了含量，同时考察了各部位的HPLC指纹图谱，以期找到化学成分同心血管方面作用的有效部位之间的相关性，为其在心血管方面的临床应用提供实验研究依据。

　　1 仪器与材料

　　1.1 仪器岛津LC-10 A系列高效液相色谱仪;WML色谱工作站，南宁威玛龙色谱科技有限公司产品;心电图仪，日本NIHON KOHDEN公司产品;DH140人工呼吸器，浙江医科大学医学仪器实验厂产品。Langendorff法灌流装置。

　　1.2 药品与试剂荭草Polygonum orientale L.产地：贵州省惠水县，采收期9月，

　　由贵阳医学院药物研究所生药学研究室龙庆德副教授鉴定。复方丹参注射液，上海通用药业股份有限公司第三公司产品;异荭草素和荭草素对照品是从荭草中分离、纯化而得，经NMR、MS鉴定为异荭草素、荭草素(另文报道)，HPLC归一化法测定其纯度均在98%以上;原儿茶酸对照品(中国药品生物制品检定所)。硝基四氮唑蓝(NBT)，上海前进试剂厂产品。

　　1.3 动物 SD大鼠，体质量250～300 g;家兔，体质量 2～2.5 kg;雌雄兼用，由贵阳医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(黔)2002-0001。

　　2方法

　　2.1 样品制备取荭草各药用部位(全株、根及粗茎、带叶茎枝、花穗)，水煎煮提取浓缩后65%乙醇沉淀，滤液浓缩，加水微热溶解，调pH至6，滴加明胶溶液至无沉淀产生，再加乙醇使含醇量达75%，静置，滤过，回收至近干，以注射用水稀释至每毫升含2 g生药，调pH值至7，煮沸，滤过，冷藏24 h，用0.45 μm微孔滤膜滤过，滤液分装，灭菌，备用。各药用部位样品分别记为A组、B组、C组、D组。

　　2.2 剂量设置 根据《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003 年版)荭草用药剂量和预试验药效学结果，设定了本实验剂量方案。

　　2.3抗实验性心肌缺血实验[11]

　　2.3.1 对大鼠急性心肌梗塞心电图的影响 取雄性SD大鼠，随机分为6组，分别为模型对照组，阳性对照组(复方丹参)，样品A(全株)组、B(根及粗茎)组、C(带叶茎枝)组、D(花穗)组。动物用10%乌拉坦麻醉，固定，将针形电极插入四肢皮下，连接心电图机，记录正常肢体Ⅱ导联心电图。打开胸腔前接上人工呼吸机，各组动物结扎左冠状动脉前降支后，迅速关闭胸腔，恢复呼吸，记录心电图，有明显J段抬高或压低者为手术成功征象(剔除未出现明显心肌梗塞心电图波形者)。结扎后即刻分别股静脉给药，模型组给予等体积生理盐水。记录结扎后5，15，30，60，120 min各时间点心电图，计算各时间J点上下偏移mV数。

　　2.3.2 对大鼠急性心肌梗塞范围的影响 实验结束后，立即取出心脏，用生理盐水洗净余血，剪去心房及各大血管、筋膜、心耳等，称取心室重量，然后将心肌切成等厚度的5片，置于37 ℃ 0.5%NBT染色液中染色10 min，取出剪去被染色的非梗塞心肌，称重未染色的梗塞区心肌，以重量法计算心肌缺血区百分率。

　　2.4对离体兔心冠脉流量的影响[11]取家兔，雌雄兼用，击后脑致昏，迅速开胸取出心脏，按Langendorff法主动脉插管，心脏固定在灌流装置上后，用恒温38 ℃±0.5 ℃且不间断通入纯氧的Ringer-Lock’s液灌流，灌流压恒定为50 cmH2O。待灌流稳定后，采取交叉给药法，分别由灌流侧管注入供试药液，观察记录给药前、后1 min的流量值。

　　2.5 异荭草素、荭草素和原儿茶酸含量测定 参照文献[7，8]方法，采用高效液相色谱法测定药材各部位上述指标。测定异荭草素、荭草素色谱条件：Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相乙腈-0.1%磷酸水溶液(18∶82)，流速1 ml·min-1，柱温40℃，检测波长350 nm;测定原儿茶酸色谱条件：Hypersil C18色谱柱(5 mm×250 mm，5 μm)，流动相甲醇-水(10∶90)，流速1 ml·min-1，柱温40 ℃，检测波长258 nm。

　　2.6 HPLC指纹图谱测定 参照文献方法[9，10]，采用高效液相色谱法测定药材各部位指纹图谱。色谱条件为：色谱柱Inersil ODS-3柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，日本GL Sciences Inc.);流动相A为乙腈，B为0.1%磷酸，梯度洗脱：0 min～45 min，A(13%～21%);45 min～60 min，A(21%～33%)，柱温35 ℃;流速1 ml·min-1;检测波长 300 nm。

　　2.7 数据统计处理 数据以±s表示，采用Student’s-t检验。